Wir danken Zehavit Frenkel und Sandra Tolchinsky für technische Unterstützung. Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit wird durch Zuschüsse von der Israel Science Foundation (1229-1207) und Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP-DFG) unterstützt.

Das folgende Protokoll ist für die Analyse der Zuckerketten von insgesamt Glykoproteine ​​oder eines bestimmten Glykoproteins von Interesse bestimmt. Das Verfahren ist grundsätzlich das gleiche für die beiden Fälle mit ein paar Änderungen, wie in dem Protokoll angegeben. <ol><li> Für metabolische Markierung von N-verknüpften Glykane, muss man eine subkonfluenten Kultur von Säugerzellen über Nacht in einer 90 mm-Schale für jede Probe gewachsen verwenden (Proben repräsentieren verschiedene Zeitpunkte oder Behandlungen). Dieses Protokoll wird für NIH 3T3-Zellen optimiert. </li><li> Hungern der Zellen für Glukose durch Inkubation in 5 ml frisch zubereiteter vorgewärmten (37 ° C) Glucose-freiem Medium mit 10% dialysiert FCS und 4 mM Natriumpyruvat für 5-15 Minuten geliefert. </li><li> Ersetzen Sie den Hungertod Medium mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Glucose-freiem Medium mit 400 uCi [2 bis 3 H]-markierte Mannose (niedrigere Konzentration von 65 Ci / ml ist für die Kennzeichnung von insgesamt Glykoproteine ​​verwendet werden), und inkubieren Sie die Zellen in den normalen Gewebekulturen Bedingungen für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie die Markierung Medium von jeder Probe, und vorsichtig 2 ml PBS bei 4 ° C, um die Proben entsprechend Puls und legen sie auf Eis (dieser Proben werden als Impulse bezeichnet), während die Proben entsprechend der Jagd zu sein brauchen gespült 3 mal mit 2 ml vorgewärmten (37 ° C) normal komplettem Kulturmedium, und dann in einer CO 2-Inkubator bei 37 ° C mit 5 ml vorgewärmten regelmäßigen Medium für die gewünschte Chase Perioden. </li><li> Spülen Sie den Puls Proben (vorher auf Eis gelegt) 3 mal mit 2 ml eiskaltem PBS. Die Zellen werden dann von der Schüssel in 2 ml PBS mit einem Zellschaber abgekratzt, und in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Short-spin die Zellen bei 16000Xg (6-10 sec), den Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -80 ° C. </li><li> Führen Sie die Schritte 5 und 6 auch für die Jagd Proben am Ende der Verfolgungsjagd Zeit. </li><li> Entfernen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank und lysieren sie durch Zugabe von 300 ul Puffer A, Vortexen kurz und Inkubation für 20 min auf Eis oder im Falle von insgesamt Glykoproteine ​​Analyse durch Inkubation 20 min auf Eis mit Puffer B, mit anschließender Ultraschallbehandlung (4-mal, 10 sec, maximale Amplitude), dann kochen die Proben für 5min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Lysate bei 16000Xg für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf Tube und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Wenn die Analyse insgesamt Glykoproteine, die molekulare Filtration und Deglykosylierung (Schritt 17) fort. Für Immunpräzipitation der H2a Glykoprotein hier demonstriert, fügen 20l/sample von (Repligen) Protein A-Agarose-Beads 1:1 Aufhängung und 3 pl / Probe unserer polyklonalen Kaninchen-anti H2a Antikörper für die gewünschte Glycoprotein (in unserem Beispiel anti-H2a Antikörper ), der Überstand aus Schritt 9 fort. </li><li> Inkubieren Sie die Proben für 4-16 Stunden bei 4 ° C, dauernd Mischen durch langsame Rotation. </li><li> Spin down die Perlen an 16000Xg für 30 Sekunden, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Vakuum. </li><li> Spülen Sie die Perlen, durch Zugabe von 500 ul Puffer D und Vortexen. Spin wie in Schritt 12 und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 3 x waschen. </li><li> Add 10 &amp;mgr; l Denaturierungspuffer (im Lieferumfang der NEB endo-H-Kit), um den Wulst Pellet und kochen die Proben für 5 min (bei insgesamt Proteine ​​analysiert werden, die Deglykosylierung befindet sich auf der Microcon Filter, Schritt 17 durchgeführt). </li><li> Spin down die Perlen (16000Xg für 30 Sekunden) und den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Dann 0.5μl von Endo H-Enzym sind zu jeder Probe zusammen mit 10 ul des Reaktionspuffer (auch mit der NEB Endo H-Kit im Lieferumfang enthalten) hinzugefügt und die Proben werden bei 37 ° C für 3 Stunden. </li><li> Zur Trennung der freigesetzten Glykane von den Proteinen, wird die Probe 5 mal mit deionisiertem Wasser verdünnt und auf der Spitze eines molekularen Filter (Microcon Ultracel YM30), mit einem 30-kDa cut-off, dann 14000Xg für 3 min zentrifugiert. Übernehmen 50 ul entionisiertem Wasser und wiederholen Zentrifugation der Proben. Das Auswaschen wird 2 weitere Male wiederholt, halten die Durchströmung. </li><li> Wenn Sie die Analyse insgesamt Glykoproteine ​​sind, gelten dem Überstand der Lysate (aus Schritt 9), die Microcon Filter. Der Extrakt wird mit 100 ul Puffer E, 3-mal durch wiederholte Zentrifugation bei 14000Xg für 3 min. Add 3 ul 10x Endo H Reaktionspuffer und 1,5 ul des Endo H-Enzym, die Microcon Retentat, und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C. Die freigesetzten Glykane sind mit entionisiertem Wasser durch 3 wiederholt Zentrifugationen eluiert, wie in Schritt 16. </li><li> Falls gewünscht, werden Retentate aus den Schritten 16 und 17, mit Endo H-resistente Glykoproteine ​​dann mit 200mU von N-Glycosidase F in 15 ul Puffer C inkubiert, bei 37 ° C für 16 h Elution mit deionisiertem Wasser wird wie in Schritt 16 durchgeführt. </li><li> Das Röhrchen mit dem Endo H Reaktion Flow-Through-(Stufen 16 und 17) in einem SpeedVac KonzentratorUnd trocknen die Proben vollständig (dies kann bis zu 45 erfolgen ° C, um diesen Prozess zu beschleunigen). </li><li> Zur Vorbereitung der Proben für die HPLC, resuspendieren die trockenen Pellets in 12 ul der HPLC Lösungsmittel (Acetonitril: Wasser, 60:40, 1% Phosphorsäure). </li><li> Passen Sie die HPLC-Gerät (verbunden mit dem Spherisorb Spalte) zu konstanten Fluss des Lösungsmittels (1 ml / min) und Druck (ein bestimmter Wert zwischen 1000 und 2000 psi), und setzen Sie ein Fraktionssammler Änderungen ein Rohr alle 1 Minute. </li><li> Laden Sie die Proben in die HPLC-Gerät und starten Sie den Fraktionssammler gleichzeitig. </li><li> Sammeln Sie 48 Fraktionen von 1 ml von jeder Probe laufen und ab einer Auflage von einer Standard-Oligosaccharid-Gemisch. </li><li> Transfer 500 ul von jeder Fraktion ein Scintillationsfläschchen, und mischen Sie den Inhalt mit 3 ml Wasser mischbar Szintillationsflüssigkeit. </li><li> Laden Sie das Fläschchen und lesen in einem Szintillationszähler. </li><li> Die cpm-Anzeige wird als Funktion der Fraktion Zahl aufgetragen. </li><li> Die cpm-Werte innerhalb einer Spitzenleistung stellen eine besondere Glycanspezies wie folgt: Fraktionen 18-21 bis M5, Fraktionen 22-26 bis M6, Fraktionen 27-31 bis M7, Fraktionen 32-35 entsprechen M8, Fraktionen 36-39 bis M9, Fraktionen 40-42 zu G1M9 und Fraktionen 43-45 zu G2M9. </li><li> Die Summe der cpm-Werte für die Fraktionen innerhalb der einzelnen Gipfel spiegelt die absolute Menge eines bestimmten Glycanspezies. Die absolute Höhe der einzelnen Glycanspezies wird durch die Anzahl der Mannoseresten, die es enthält unterteilt: Um sich für die Tatsache, dass Spezies mit mehr Mannoseresten mehr label, die &quot;relative molare Menge&quot; von jedem Glycanspezies berechnet sich wie folgt erwerben zu kompensieren . Dieser Wert wird dann durch die Summe der relativen molaren Mengen aller Glycanspezies erhalten, um die &quot;Prozent aller&quot; für jede spezifische Glycanspezies dividiert. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Freigegeben mit Endo H (cpm) eine </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> Freigegeben mit N-Glycosidase F (cpm) b </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Glykoproteine ​​in Retentat (cpm) c </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-Oligosaccharide in Retentat (cpm) d </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-Oligosaccharide in Retentat (%) e </td><td> 1,4 ± 0,7 </td><td> 0,2 ± 0,2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Analyse der Freisetzung von N-verknüpften Zuckerketten mit deglycosidases und der Anwesenheit von Dolichol-Oligosaccharide in Glykoprotein Proben. Wir wendeten die Pulse-Chase-Verfahren, um ein Lysat von NIH 3T3-Zellen. Nach Microcon Filtration, wurden als N-gebundene Oligosaccharide in erster Linie mit Endo H nach Puls Kennzeichnung (high Mannose-Typ) und bei weiterer Behandlung mit N-Glycosidase F nach einer Verfolgungsjagd aus, was zu komplexen Typs (Golgi-verarbeitet Glykane) entsprechen würde entlassen, Endo H resistent Oligosaccharide. Diese quantitative Analyse festgestellt, dass Dolichol-Oligosaccharide, entfielen einen unbedeutenden Bruchteil des Etiketts in der ersten Retentat. Notes: <ol class="lalpha"><li> NIH 3T3-Zellen wurden Puls mit [2 bis 3 H] Mannose und jagte mit Komplett-Medium. Nach Zelllyse und Filtration durch Microcon YM30 wurden hohe Mannose N-gebundene Oligosaccharide aus Retentate durch Inkubation mit Endo H. veröffentlicht </li><li> Endo H-resistentem Material in Microcon Retentate aus (a) wurde dann mit N-Glycosidase F inkubiert und freigegeben Oligosaccharide in einem Szintillationszähler gemessen. </li><li> : Methanol: Wasser 10.10.03 um Vorläufer Glykolipide entfernen, und die extrahierten Material in 1N NaOH gelöst und in einem Szintillationszähler Microcon Retentate wie in (a) vor dem Endo H-Behandlung wurden 4 mal mit Chloroform extrahiert wird. </li><li> Dolichol-Oligosaccharide wurden aus Extrakten aus (c) wie in 1 beschrieben und in einem Szintillationszähler gereinigt. </li><li> Durchschnitt von 3 Experimenten für Prozent Dolichol-Oligosaccharide (d) der gesamten cpm in Retentat (c + d). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Pulse-Chase Analyse der gesamten NIH 3T3 Glykoproteine ​​in unbehandelten Zellen und auf proteasomalen Hemmung Nach 1h Puls-Markierung mit. [2 bis 3 H] erhielten wir eine erwartete Profil mit einigen glucosyliertenVorläufer restlichen (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) und G1M9), aber die meisten der Label in M9 und M8 Arten, wobei letztere das Ergebnis Trimmen aller Glucose und einem Mannoserest (Abbildung 1 A). Kein freier Mannose oder andere kleine Vorstufen festgestellt wurden, hervorgeht, dass die Gründlichkeit der Reinigung. Nach einer ziemlich langen 8h jagen gab es umfangreichere Trimmen M7-6 und eine kleine Menge von M5, aber die großen Arten weiter M9 und M8 (Abbildung 1 B). Wenn die Jagd in der Gegenwart eines proteasomalen Inhibitor (30 uM MG-132) durchgeführt wurde, gab es nur eine geringe Akkumulation dieser gleichen getrimmt Spezies (Abbildung 1 C). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Quantitative Analyse der Zuckerketten eines ERAD Substrat insgesamt Glykoproteine ​​verglichen. (A) In einem Experiment, ähnlich dem in Abbildung 1 wurden relative molare Mengen von jedem Oligosaccharid Arten basierend auf Mannose-Gehalt berechnet. Wir konvertierten die cpm-Werte für jedes Glycanspezies erhalten, der prozentuale Anteil der einzelnen Arten bezogen auf die gesamte Summe der relativen molaren Mengen aller Arten, die damals als eine Funktion der Jagd Zeit für einen Durchschnitt von zwei Experimenten aufgetragen. (B) Ähnliche zu (A), außer dass Glykane vom ERAD Substrat ASGPR H2a veröffentlicht wurden analysiert nach dem Puls Kennzeichnung und Verfolgung von bis zu 4h, in der Gegenwart oder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitor MG-132. (C)-Werte für 4h Jagd in der Gegenwart von MG-132 aus (A) und (B) sind für ASGPR H2a und das Glykoprotein Pool verglichen. (D) Schema von N-verknüpften Zucker-Kette Trimmen Prozesse in der ER. Zucker Trimmen Prozesse, die M6-5-Leitung in Verbindung mit Proteinen (R), dass eine gezielte, um ERAD sind im Vergleich zu M9-8 auf diejenigen, Ausgang zum Golgi und darüber hinaus. Die Ergebnisse zeigen, dass die ERAD-Prozess mit dem Mannose Trimmen von N-Glykane von Arten mit 5-6 Mannoseresten restliche Ausbeute verbunden ist.

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

Die Pulse-Chase Analyse der Glykane in lebende Zellen mit HPLC-Trennung bietet eine Methode zur Untersuchung der Dynamik von Oligosaccharid bauliche Veränderungen während der gesamten Lebensdauer eines Glykoproteins. Es gibt zunehmend Beweise, dass solche Änderungen bei der Erzeugung der Signale für ER falten, Qualitätskontrolle und-handel Systemen 2-5 sind beteiligt. Die Methode kann nicht nur für einen bestimmten Glykoprotein von Interesse, sondern auch für die Analyse der Dynamik der Struktur der ge...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

Die Befestigung der Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Man<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Vorläufer Oligosaccharid entstehenden Polypeptide in der Notaufnahme ist eine übliche Variante für sekretorische Proteine. Obwohl diese Änderung in mehrere biologische Prozesse verwickelt war, sind weitere Aspekte ihrer Funktion entstehenden, mit den letzten Beweis für seine Rolle in der Produktion von Signalen für Glykoprotein Qualitätskontrolle und-handel. So sind Phänomene im Zusammenhang mit N-Glycane und deren Verarbeitung intensiv untersucht. Methoden, die kürzlich für Proteomanalyse entwickelt haben stark die Charakterisierung von Glykoprotein N-Glycane verbessert. Dennoch liefern sie keine Einsicht in die Dynamik des Zuckers Kette der Verarbeitung beteiligt. Dafür sind die Kennzeichnung und Pulse-Chase Analyse-Protokolle verwendet, sind meist komplex und geben sehr geringen Ausbeuten. Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Isolierung und Analyse von metabolisch markierten N-gebundene Oligosaccharide. Das Protokoll ist für die Kennzeichnung von Zellen mit [2 basiert -<sup&gt; 3</sup&gt; H] Mannose, denaturierenden Lyse und enzymatische Freisetzung der Oligosaccharide entweder aus einem speziell immunpräzipitiert Protein von Interesse oder aus dem allgemeinen Glykoprotein-Pool durch sequentielle Behandlung mit Endo H und N-Glycosidase F, durch molekulare Filtration (Amicon) gefolgt. Bei dieser Methode der isolierten Oligosaccharide dienen als Input für die HPLC-Analyse, die eine Diskriminierung zwischen verschiedenen Glykanstrukturen ermöglicht je nach Anzahl der Monosaccharideinheiten aus ihnen, mit einer Auflösung von einem Monosaccharid. Mit dieser Methode konnten wir hohe Mannose N-linked Oligosaccharid Profile von insgesamt Zelle Glykoproteine ​​nach Pulse-Chase in normalen Bedingungen und unter Proteasom-Hemmung. Diese Profile wurden mit denen aus einem immunpräzipitiert ER-assoziierte Degradation (ERAD) Substrat verglichen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die meisten NIH 3T3 Zellen Glykoproteine ​​relativ stabil sind und dass die meisten ihrer Oligosaccharide sind auf den Menschen zugeschnitten<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. Im Gegensatz dazu sind instabil ERAD Substrate Man getrimmt<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Und Glykoproteine ​​tragen diese Arten sammeln auf Hemmung der Proteasom abgebaut.

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Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Aufrufe.  Tel Aviv University. Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.

Serie: Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Forschung

Biologie

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...