Dieses Protokoll eignet sich, um zu untersuchen, woher präsynaptische Proteine stammen: Zellkörper oder Axone. Und wie sich präsynaptische Proteine während der Synapsenbildung in Präsynapsen organisiert ansammeln. Diese Technik kann Tausende von Präsynapsen zur gleichen Zeit induzieren, und verwendet keine speziellen Geräte, um Axone in der Kultur zu erhalten, was eine effiziente Analyse der Bildung vieler Präsynapsen in Axonen ermöglicht.
Zusammen mit dem Doktoranden Honami, der dieses Verfahren demonstriert, wird Rie Ishii, ein Student in meinem Labor sein. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Euthanasie der Maus, wie im Textprotokoll beschrieben. Sezieren Sie den Bauch, um E16-Embryonen zu erhalten.
Entfernen Sie die Gehirne von Embryonen vorsichtig mit Hilfe von feinspitzen Zangen, und übertragen Sie sie in 60-Millimeter-Zellkultur-Gerichte mit vier Milliliter HEPES gepufferte Salzlösung oder HBSS. Entfernen Sie die Meninges und schneiden Sie die Olfaktor-Lampe. Trennen Sie Kortiken von jeder zerebralen Hemisphäre mit den feinen Spitzen der Zange unter dem Stereomikroskop und übertragen Sie auf eine andere 60-Millimeter-Schale mit frischem HBSS.
Verwenden Sie mindestens drei bis fünf Embryonen für jede einzelne Neuronenkugelkultur. Schneiden Sie die Kortiken in kleine Stücke mit mikrosezierenden Federscheren in einer laminaren Flow Cell Culture Kapuze. Nun, übertragen Gehackte Kortiken auf eine 15-Milliliter-Röhre.
Versuchen Sie die gehackten Kortices in vier Milliliter von 0,125%Trypsin in HBSS für 4,5 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Zellaggregate durch eine sterile Transferpipette in ein neues 15-Milliliter-Rohr mit 10 MilliliterHBSS. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie diesen Schritt ein anderes Mal wiederholen.
Übertragen Sie dann die Zellaggregate in ein neues 15-Milliliter-Rohr, das zwei Milliliter NGB-Medium, 0,01%DNase I und 10% Pferdeserum enthält. Trituieren Sie die trypsinisierten Kortiken, indem Sie sie mit einer feuerpolierten Pasteurpipetette aus feinem Glas immer wieder drei- bis fünfmal nach oben und unten pfeifen. Passen Sie für die Herstellung von Neuronenkugeln die Zelldichte in der Zellsuspension mit NGB-Medium auf eine Million Zellen pro Milliliter an.
Fügen Sie sieben Milliliter PBS in den unteren Teil der Kulturgerichte. Kultur die kortikalen Neuronen als 10 Mikroliter hängende Tropfen mit 10.000 Zellen pro Tropfen in den oberen Deckeln von 10-Zentimeter-Kulturgerichte. Halten Sie die Gerichte in einem Brutkasten für drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 unter befeuchteten Bedingungen, um Neuronenkugelbildung zu ermöglichen.
Mantel Poly-L-Lysin oder PLL auf die Paraffin-Perlen-Glasabdeckung rutscht in 60-Millimeter-Schalen mit einer 15 Mikrogramm pro Milliliter PLL-Lösung in Boratpuffer. Halten Sie sie mindestens eine Stunde in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius auf. Nach dem viermaligen Waschen mit PBS die PLL-beschichteten Abdeckungsscheine auf eine Vier-Well-Platte mit 350 Mikroliter NGB-Medium mit jeweils drei Mikromolaren AraC in jedem Brunnen übertragen.
AraC wird den Medien hinzugefügt, um teilende Zellen abzutöten. Die Vier-Brunnen-Platten mit den PLL-beschichteten Abdeckungsrutschen im CO2-Inkubator für mindestens 20 Minuten inkubieren, um sicherzustellen, dass die Temperatur des Mediums 37 Grad Celsius erreicht, bevor die Neuronenkugeln übertragen werden. Bei DIV 3, wenn Neuronkugeln sehr gut ausgebildet sind, übertragen Sie sie auf PLL-beschichtete Abdeckungsslips.
Innerhalb der Vier-Well-Platte, fügen Sie fünf Neuronkugeln pro Brunnen. Bei DIV 11 20 Mikroliter von der Suspension von Streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Immobilisieren Sie die Perlen zu einem handgefertigten Gerät, das mit Neodym-Permanentmagneten befestigt ist, und waschen Sie dreimal mit 100 MikroliterPBS-MCBC in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren.
Nachdem Sie PBS-MCBC vollständig aus den Perlen entfernt haben, fügen Sie den gewaschenen Perlen ein vorgegebenes Volumen an LRRTM2-Lager hinzu. Inkubieren Sie die Mischung mit einem Rotator bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Stunden. Waschen Sie die Perlen nach der Inkubation zweimal mit 100 MikroliterPBS-MCBC.
Dann waschen Sie die Perlen mit 100 Mikroliter NGB Medium. Setzen Sie die LRRTM2 Perlen in 50 Mikroliter NGB Medium für die Anwendung auf die Neuronenballkultur. Schneiden Sie nun das Ende einer gelben Spitze im 45-Grad-Winkel mit einer Rasierklinge unter dem Stereomikroskop.
Setzen Sie das gelbe Spitzenende auf den Zellkörperbereich eines Neuronenballs und entfernen Sie die Zellkörper durch Absaugen. Tragen Sie die LRRTM2 und Kontrollperlen auf die Neuronenballkultur. Dann tauchen Sie die Perlen auf den Boden der Platten der Neuronenkugelkultur für eine Minute mit Ferrit-Magneten, um die Vor-Synapse-Bildung zu starten.
Dieses Verfahren sorgt dafür, dass alle Perlen gleichzeitig touchdown. Fixieren und färben Sie die Neuronen in der Neuronenballkultur nach der Präsynapsenbildung mit Perlen, wie im Textprotokoll beschrieben. Erfassen Sie Differentialinterferenzkontrast- und Immunfluoreszenzbilder unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer gekühlten CCD-Kamera mit einer 60-fachen Öl-Tauchlinse.
Messen Sie die Immunfluoreszenzintensität in Vorsynapsen im Axon. Verwenden Sie Immunfluoreszenzintensitäten der Region von Interesse auf Perlen. Minus die Off-Perlen-Region Intensität geteilt durch die axonale Intensität, entlang 20 Mikrometer von den Perlen.
Minus Hintergrundintensität. Diese Verhältnisintensität liefert den Proteinakkumulationsindex. Um den Akkumulationsgrad eines bestimmten Proteins in einer mit LRRTM2-Perlen induzierten Präsynapse zu quantifizieren, wählen Sie immer den Bereich aus, der zwei Sichtfelder oder mehr apart, außer dem Zellkörper.
Wählen Sie für eine genaue Messung fünf verschiedene Axonfelder pro Deckslip aus. Gezeigt wird hier die Anwendung von LRRTM2-Perlen in die Neuronenballkultur bei DIV 11 induzierte Akkumulation von Munc18-1 in Vorsynapsen von Axonen von Neuronenkugeln. Die Perlen auf Axonen von Neuronenkugeln sind in den Phasenmikroskopiebildern sichtbar.
Und die Anhäufung von präsynaptischen Proteinen wird durch die Immunfluoreszenzbilder beobachtet. Selbst bei Axonen, die zellkörperentfernt sind, wurde die Ansammlung von Munc18-1 unter den Perlen beobachtet, ähnlich wie Axone von Neuronenkugeln mit Zellkörpern. Als die periphere Region des Axonalblattes mit einer objektiven Linse mit hoher Vergrößerung analysiert wurde, akkumulierten sich vGlut1 und Munc18-1 deutlich in Vorsynapen von Axonen unter den Perlen mit und ohne Zellkörper.
Zeitverlaufsexperimente zeigten, dass die Ansammlung von vGlut1 in Presynapsen nach 30 Minuten signifikant zunahm. Auf der anderen Seite begann die Akkumulation von Munc18-1 nach zwei Stunden deutlich zuzunehmen und erreichte ein Plateau mit vier Stunden. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich das synaptische Vesikelprotein vGlut1 in Vorsynapsen früher als das Wirkstoffprotein Munc18-1 ansammelt.
Die Munc18-1 Akkumulation in Presynapsen von Fmr1-KO Neuronen stieg 1,5 mal mehr als diejenigen in wildem Typ, was auf die Beteiligung von FMRP in Munc18-1 Akkumulation. Proteinsynthesehemmer, Anisomycin, unterdrückte die Munc18-1-Akkumulation signifikant in Axonen mit und ohne Zellkörper. Dies deutet darauf hin, dass die Akkumulation proteinsyntheseabhängig ist.
Ein wichtiger Schritt ist das Pipettieren der trypsinisierten Kortiken mit einer feuerpolierten Pasteurpipetten-Pipette aus feinem Glas. Die Experimentatoren bereiten die feuerpolierten Pipetten mit zwei bis drei verschiedenen Durchmessern vor und wählen eine Pipette mit einem entsprechenden Durchmesser. Mit diesem Verfahren wird die synaptische Freisetzung von Präsynapsen, die durch LRRTM2-Perlen induziert werden, durch Live-Bildgebung gemessen.
Diese zusätzliche Methode würde beantworten, ob die Proteinsynthese in Axonen an der Regulierung der synaptischen Freisetzung beteiligt ist. Mit dieser Methode untersuchen die Forscher, wie sich präsynaptische Proteine in Präsynapsen in organisierter Weise ansammeln, sowie die Lage der Quelle von präsynaptischen Proteinen.
