Dieses Protokoll bietet ein facettenreiches Verständnis der Aktivierung von Zelltodprozessen, das entscheidende Einblicke in Krankheitsmechanismen und therapeutische Strategien liefern kann. Dieses Protokoll beruht auf der Verwendung einer einfacheren Technik und dem Zugriff auf die Aktivierung mehrerer Caspasen, die von einer einzigen Population endogener Zellen unerlässlich sind, um die Aktivierung stark zu bestimmen. Der angeborene Zelltod des Immunsystems wurde über das gesamte Krankheitsspektrum hinweg in Verbindung gebracht, von Infektionen über entzündliche Erkrankungen bis hin zu Krebs.
Das Verständnis der molekularen Mechanismen des Zelltods durch Caspase-Aktivierung kann entscheidende Einblicke in Krankheitsprozesse liefern. Dr. Julieann, eine Postdoktorandin aus einem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie das Knochenmark isoliert und die BMDMs differenziert haben, infizieren Sie die Zellen mit dem Influenza-A-Virus.
Berechnen Sie das Virusvolumen, das bei einer Vielzahl von Infektionen von 20 plaquebildenden Einheiten benötigt wird. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und waschen Sie die Zellen einmal mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie 450 Mikroliter Influenza-A-Virus in DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne hitzeinaktiviertes FBS in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator, um die Absorption zu ermöglichen.
Fügen Sie am Ende der einstündigen Inkubation 50 Mikroliter hitzeinaktiviertes FBS hinzu und geben Sie die Platten für insgesamt 12 Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator zurück. Entfernen Sie die Platte nach 12 Stunden Inkubation aus dem Inkubator. Saugen Sie 150 Mikroliter des Überstands ab und verwerfen oder bewahren Sie diese für die Analyse des Überstands auf.
Entfernen Sie nicht den restlichen Überstand. Erstellen Sie nun die Proteinsammellösung, indem Sie 50 Mikroliter Caspase-Lysepuffer und 100 Mikroliter vier XSDS-Puffer pro Well kombinieren. Geben Sie dann 150 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung.
Für jede Vertiefung pipettieren Sie die Mischung, um die lysierten Zellen und den Überstand zu sammeln. Kratzen Sie während des Pipettierens mit der Pipettenspitze den Boden der Vertiefung ab, um die Zellen aufzubrechen. Nach dem Schaben und Pipettieren das Proteinlysat in markierten 1,5-Milliliter-Röhrchen sammeln.
Erhitzen Sie alle Röhrchen mit einem Heizblock 12 Minuten lang auf 100 Grad Celsius. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Heizblock und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 14.500 G, um unlösliche Bestandteile zu pelletieren. Bereiten Sie das Elektrophoresegerät mit einem 12%igen Polyacrylamid-Gel mit 10 Vertiefungen vor.
Füllen Sie das Elektrophoresegerät mit laufendem Puffer und entfernen Sie den Gelkamm. Dann erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben vor dem Laden bei 14.500 G 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.
Laden Sie dann langsam 30 Mikroliter der Probe in jede Vertiefung. Verwenden Sie kombinierten Überstand und Proteinlysat und Caspase-Lysepuffer oder das Gewebehomogenat für Caspase 1, 3, 7 und 8 Blots und verwenden Sie den im Protokoll beschriebenen Proteinlysat-DN-RIPA-Puffer oder das Gewebehomogenat für Caspase 11 und 9. Um alle sechs Caspasen gleichzeitig zu bewerten, verwenden Sie das gleiche Verfahren, um die gleichen Proben in jedes der sechs Gele zu laden.
Schließen Sie das Elektrophoresegerät an die Stromquelle an und stellen Sie die Leistung 20 Minuten lang auf 80 Volt ein, um den Gellauf zu starten. Stellen Sie nach den ersten 20 Minuten die Leistung für 45 bis 60 Minuten auf 100 Volt ein. Beobachten Sie die Farbstofffront.
Sobald die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht, schalten Sie das Gerät aus. Während das Gel läuft, bereiten Sie den Transferpuffer wie im Manuskript beschrieben vor. Machen Sie die Lösung jedes Mal frisch.
Entfernen Sie das Gel mit dem Gel-Trennmittel aus dem Elektrophoresegerät. Um den Transferstapel für das Gel einzurichten, aktivieren Sie eine PVDF-Membran, indem Sie sie eine Minute lang in Methanol einweichen. Befeuchten Sie zwei Stücke Filterpapier, das Gel und die PVDF-Membran und den Transferpuffer fünf Minuten lang.
Bewahren Sie die PVDF-Membran und das Gel während dieser fünfminütigen Inkubation in getrennten Behältern auf. Beginnen Sie mit der Montage des Transferstapels auf dem halbtrockenen System. Legen Sie auf die untere Platin-Nano-Seite ein Stück Filterpapier, die PVDF-Membran, das Gel und schließlich ein Stück Filterpapier.
Luftblasen zwischen den Schichten vorsichtig ausrollen oder ausdrücken und die Oberseite des Systems schließen. Schließen Sie nun die Stromquelle an. Stellen Sie die Stromversorgung für 40 Minuten auf 25 Volt ein.
Zerlegen Sie nach dem Transfer den Transferstapel, sammeln Sie die Membran und legen Sie sie in eine quadratische Petrischale. Als nächstes führen Sie eine Membranblockierung durch, indem Sie 15 Milliliter einer 5%igen Magermilchlösung hinzufügen und die Membran eine Stunde lang auf einem Schaukelschüttler bei 50 bis 70 U / min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Blockierlösung, fügen Sie 10 Milliliter der verdünnten Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius über Nacht auf einem Schaukelschüttler, wie zuvor gezeigt.
Sammeln Sie dann die Antikörperlösung und waschen Sie die Membran, indem Sie der Membran 10 Minuten lang 15 Milliliter TBST auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur hinzufügen. Entsorgen Sie die TBST. Wiederholen Sie den Waschgang mit 15 Millilitern TBST dreimal.
Fügen Sie 10 Milliliter der verdünnten sekundären HRP-konjugierten Antikörperlösung hinzu. Eine Stunde lang auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur inkubieren. Am Ende der Inkubation, sobald die Antikörperlösung entfernt ist, waschen Sie die Membran, indem Sie 15 Milliliter TBST auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur für 10 Minuten hinzufügen.
Nachdem Sie die Waschschritte abgeschlossen und das TBST entfernt haben, fügen Sie 10 Milliliter des hochempfindlichen HRP-Substrats hinzu. Lassen Sie es eine Minute bei Raumtemperatur ruhen. Entfernen Sie die Membran vom Substrat.
Fahren Sie direkt mit der Bildgebung fort, indem Sie einen Chemilumineszenz-Imager verwenden, wobei das weiße Zubehörfach in der unteren Position eingesetzt wird. Belichten Sie die Membran mit dem automatischen Belichtungsmodus. Analysiert werden die Pro- und aktivierten Caspase 1, 11, 3, 7, 8 und 9 in Wildtyp- und ZBP1-Mutanten nach Influenza-A-Virusinfektion, Wildtyp- und AIM2-Mutante nach HSV1-Infektion und Francisella novicida-Infektion oder Wildtyp- und NLRP3-Mutanten-BDMs nach Lipopolysaccharid- und ATP-Stimulation.
Zellen, denen vorgeschaltete PANoptose-Sensoren fehlen, durchlaufen keinen robusten Zelltod als Reaktion auf die verwandten PANoptose-induzierenden Reize. Eine Influenza-A-Virusinfektion induziert die Bildung des ZBP1-PANoptosoms und die ZBP1-defizienten Zellen sind während einer Influenza-A-Virusinfektion signifikant vor dem Zelltod geschützt. In ähnlicher Weise induzieren HSV1- und Francisella novicida-Infektionen die Bildung des AIM2-PANoptosoms, und AIM2-defiziente Zellen erleiden als Reaktion auf diese Infektionen keinen robusten Zelltod.
Zellen, denen vorgeschaltete Inflammasomsensoren fehlen, sind als Reaktion auf ihre jeweiligen Reize vor dem Zelltod geschützt, und NLRP3-defiziente Zellen erleiden keinen Zelltod als Reaktion auf Lipopolysaccharid und ATP. Es ist wichtig, daran zu denken, eine Mischung aus beiden Zelllysaten herzustellen, um eine bestimmte Caspase zu bestimmen. Nach dem Laden des Jets sollte die leuchtende Probe bei minus 20 Grad gelagert werden, um die Integrität der Caspase-Ziele für die Nachverfolgung aufrechtzuerhalten In Verbindung mit diesem Protokoll können Echtzeit-Zelltod-Bildgebung oder LDH-Assays verwendet werden, um die Ausführung des Zelltods zu überwachen, und ELIZAs können verwendet werden, um die Freisetzung von Zytokinen oder DAMPs aus Zellen zu überprüfen, die verschiedenen Arten des Zelltods unterzogen werden.
