Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Menge an Proteinen ab, die in einem bestimmten Moment auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Dementsprechend werden die Anzahl, die subzelluläre Lokalisierung und die Zusammensetzung dieser Proteine dynamisch gesteuert. Hier werden wir einen Antikörper-Fütterungsansatz verwenden, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten Rezeptoren in Zellkulturen zu quantifizieren, solange die Internalisierung und das Recycling wieder aufgenommen werden.
Dies ist ein sehr vielseitiges Protokoll, das mechanistische Informationen über die Regulierung von oberflächenausgedrückten Proteinen liefert. In unserem Beispiel werden wir Glutaminrezeptoren in primären Hippocampus-Neuronen untersuchen. Dieses Protokoll kann an jedes Protein angepasst werden, das ein anagenes extrazelluläres Epitop besitzt, wenn Antikörper nicht verfügbar sind, kann die Transvtion von markierten Konstrukten sowohl für die Kennzeichnung als auch für das Studium spezifischer Mutationen nützlich sein.
In unseren Beispielen verwenden wir Antikörper gegen endogenes GluA1 und mit Glu12 B.To dieses Verfahren zu beginnen, die Abdeckung rutscht Zellseite bis zu einem Paraffinfilm bedeckt Tablett, reagenzien zu speichern, und Manipulation zu erleichtern. Speichern und pflegen Sie konditionierte Medien bei 37 Grad Celsius für Inkubations- und Waschschritte. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern, die in konditionierten Medien bei Raumtemperatur 15 Minuten verdünnt werden.
Danach verwenden Sie eine Vakuumpipette, um den medienhaltigen Antikörper sorgfältig abzusaugen und die Zellen dreimal mit konditionierten Medien zu waschen. Wenn die Untersuchung der Oberflächen- und intrazellulären Rezeptorexpression die Zellen nach diesem Schritt mit Paraformaldehyd fixieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Pflegen Sie die Zellen in konditionierten Medien ohne Antikörper, und geben Sie sie bei 37 Grad Celsius an den Inkubator zurück, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
Wenn Sie den Internalisierungsprozess untersuchen, fixieren Sie die Zellen nach diesem Schritt mit Paraformaldehyd, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Epitope auf dem primären Antikörper zu blockieren, der an der Oberfläche exprimierte Rezeptoren, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Zellen mit unkonjugierten Fab Anti-IgG Antikörperfragmente in konditionierten Medien verdünnt, für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Danach die Zellen dreimal mit konditionierten Medien waschen.
Inkubieren Sie die gewaschenen Brunnen mit konditionierten Medien, die 80 Mikromolar Dynasore enthalten, bei 37 Grad Celsius, um das Recycling von internalisierten Rezeptoren zu ermöglichen. Nach Abschluss der Modifikationen an lebenden Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS plus. Fügen Sie den Zellen eine Lösung von 4% Paraformaldehyd und 4%Saccharose in PBS hinzu und in einer Dunstabzugshaube bei Raumtemperatur sieben bis acht Minuten zu brüten, um die Zellen zu fixieren.
Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit regelmäßigen PBS. Fügen Sie den Zellen eine Lösung von 10% Normal Goat Serum in PBS hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3%NGS in PBS bei Raumtemperatur für eine Stunde verdünnt wird, um primäre Antikörper-Label-Rezeptoren zu kennzeichnen.
Danach die Zellen dreimal mit PBS waschen. Um mit der Etikettierung der intrazellulären Rezeptoren zu beginnen, fügen Sie eine Lösung von 0,25%TritonX in PBS hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf bis zehn Minuten, um die Zellen zu permeabilisieren. Dann mit 10%NGS bei Raumtemperatur für 30 Minuten blockieren.
Wenn Sie Oberfläche im Vergleich zur Gesamtmenge untersuchen, inkubieren Sie die Zellen mit dem gleichen primären Antikörper, der zuvor verwendet wurde, verdünnt mit 3%NGS in PBS, bei Raumtemperatur für eine Stunde, um die intrazellulären Rezeptoren zu kennzeichnen. Als nächstes waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, verdünnt in 3%NGS in PBS, bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Danach waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Legen Sie zunächst die Abdeckungsrutschen, Zellseite nach unten, auf 12 bis 15 Mikroliter des entsprechenden Montagemediums, um die Zellen zu montieren. Dann stellen Sie die Zellen auf dem entsprechenden konfokalen Mikroskop ab, und analysieren Sie die Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Dieses Protokoll zur Untersuchung des Schmieramatrezeptorhandels basiert auf der Differenzkennzeichnung von Rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden, und solchen, die in internen Membranen ausgedrückt werden. Nach dem Erfassen konfokaler Bilder kann das fluoreszierende Signal leicht quantifiziert werden, um eine Zunahme der Oberflächenexpression im Verhältnis zur intrazellulären Population nach chemischer LTP zu zeigen. In nicht permeabilisierten Zellen kann kein Signal für PSD-95 empfangen werden, was die Integrität der Plasmamembran demonstriert.
Dies deutet darauf hin, dass das für die Oberfläche GluA1 erhaltene Signal tatsächlich oberflächenausgedrückten Rezeptoren entspricht. Wichtig ist, dass ein minimales Signal für internalisiertegluA1 unter Nicht-Permeabilisierungsbedingungen beobachtet werden kann, was zeigt, dass alle Oberflächenepitope durch die anfängliche Runde der Antikörperkennzeichnung belegt sind. Rezeptoren, die verinnerlicht wurden, werden dann identifiziert.
Dieses Beispiel zeigt, dass GluN2B-Phosphorylierung bei S1480 die Verinnerlichen von Rezeptoren fördert. Da die phosphomimetische Mutante S1480E ein viel höheres Internalisierungsverhältnis im Vergleich zu Wildtyp-Rezeptoren zeigte. Wie erwartet, wird kein Signal für internalisierte Rezeptoren in der Steuerung erhalten.
Als nächstes werden recycelte Rezeptoren und internalisierte Rezeptoren identifiziert. Das erzeugte Recyclingverhältnis zeigt, dass GluN2B S1480E keinen Einfluss auf das NMDAR-Recycling hat. Bei der Steuerung kann bei der Oberfläche, die GluN2B in Abwesenheit einer Fab-Blockierung ausdrückt, ein starkes Signal beobachtet werden.
Dieses Signal verschwindet in Fab-behandelten Kulturen, was zeigt, dass das Blockierungsprotokoll ausreicht, um die oberflächenausgedrückten Epitope vollständig zu blockieren, und dass die nach dem Recycling beobachteten Oberflächensignale tatsächlich Rezeptoren entsprechen, die an die Plasmamembran zurückgeführt werden. Das aktuelle Protokoll ist nur eine der Methoden, die zur Untersuchung der Regulierung von oberflächenausgedrückten Proteinen zur Verfügung stehen. Es können andere Ansätze zur Erweiterung oder Überprüfung der hier erhaltenen Daten ergriffen werden.
Dazu gehören biochemische Methoden, wie Biotinylierung, Lebensbildgebungstechniken oder funktionelle Ansätze wie Elektrophysiologie oder Kalziumbildgebung. Wir verwenden PFA, um die Lokalisation von Rezeptoren einzufrieren, aber PFA ist ein bekanntes Karzinogen, daher ist es wichtig, Schritte mit PFA unter einer Dunstabzugshaube durchzuführen, während entsprechende PSA getragen wird.
