Superkomplexe sind supramolekulare Baugruppen, die durch Atmungskettenkomplexe in der inneren mitochondrialen Membran gebildet werden. Die Bildung dieser Superkomplexe wird geglaubt, um mehrere strukturelle und funktionelle Vorteile zu verleihen, die verminderte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, Stabilisierung und effektivere Montage von einzelnen Atemkettenkomplexen, Atmungskettenaktivität Regulierung, und Prävention der Proteinaggregation in der proteinreichen Umgebung der inneren Membran. Veränderungen in der Montage und Zusammensetzung von Superkomplexen sind dynamisch und werden zunehmend gezeigt, dass Veränderungen in der mitochondrialen Funktion, die während der physiologischen Anpassung beobachtet werden, sowie eine Vielzahl von genetischen und erworbenen Krankheiten.
Dieses Video stellt ein hybrides, klar/blaues natives PAGE-Protokoll dar, um Superkomplexe präzise und zeiteffektiv aufzulösen und zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser hybriden klar/blauen nativen PAGE-Methode besteht darin, dass sie verschiedene Aspekte traditioneller blauer und klarer nativer PAGE-Protokolle optimal kombiniert, was es ermöglicht, die Exposition gegenüber Waschmitteln und anionischen Verbindungen im Vergleich zu veröffentlichten Protokollen auf ein Minimum zu reduzieren. Die optimale Trennung und Analyse von Superkomplexen wird bei großen Gradientengelen erreicht.
Dieses Verfahren erfordert mehrere heikle Schritte, die manuelle Fähigkeiten und eine sorgfältige Ausführung erfordern. Die visuelle Unterstützung des geschriebenen Protokolls bietet wichtige Tipps, die die Implementierung der Technik erleichtern. Demonstriert das Verfahren ist Alexandria, eine Doktorandin aus meinem Labor.
Zunächst zentrifugieren Sie die Ausdematorien mitochondrien aus dem tierischen Gewebe in einem 1,5-Milliliter-Rohr bei 16.000-mal-G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie das berechnete Volumen des eiskalten Extraktionspuffers, der Digitonin enthält, in das Rohr ein, um das mitochondriale Pellet wieder auszusetzen. Rohre auf einen Minirohrrotator legen und 30 Minuten bei vier Grad Celsius bei mittlerer Drehzahl inkubieren.
Zentrifugenproben bei 20, 400-mal-G für 45 Minuten bei vier Grad Celsius, um inlösliche Fragmente zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre auf Eis. Wenn die Elektrophorese nicht am selben Tag durchgeführt wird, lagern Sie Proben bei minus 80 Grad Celsius.
Öffnen Sie die Gießkammer. Legen Sie eine 20 Zentimeter mal 22 Zentimeter äußere Glasplatte in die Kammer. Positionieren Sie einen Satz von 1,5-Milliliter-Abstandshaltern mit der Ausrichtungskarte, um sicherzustellen, dass sie fest an der Seite und den Ecken der Kammer sitzen.
Legen Sie eine innere Glasplatte auf die Abstandshalter, um das Gel-Sandwich zu bilden, und legen Sie eine Kunststoff-Trennfolie auf die Glasplatte. Ordnen Sie drei weitere Gel-Sandwich-Montage. Fügen Sie bei Bedarf weitere Acrylblöcke oder Glasplatten hinzu, um den verbleibenden Platz in der Kammer einzunehmen.
Legen Sie einen Streifen Parafilm in die Nut, bevor Sie die Dichtung fest in die Dichtungskerbe setzen. Legen Sie die Deckenplatte auf die Kammer und ziehen Sie alle sechs Schrauben fest. Stehen Sie die Gießkammer.
Farbverlauf auf eine Rührplatte mit einem Magnetrührer in die Lichtmischkammer legen. Schließen Sie die Schläuche der Gießkammer an den Gradientenformer an und sichern Sie die Schläuche in der Kassette der Peristaltikpumpe. Stellen Sie sicher, dass der Stopphahn des Gradientenformergeschlossener geschlossen ist.
Um vier Gele zu gießen, bereiten Sie 60 Milliliter 4% und 60 Milliliter 12%Gel-Lösungen in zwei Erlenmeyer-Flaschen vor und wirbeln gründlich zum Mischen. Gießen Sie die 4%gel-Lösung in die Lichtmischkammer und die 12% in die schwere Reservoirkammer des Gradienten former. Rühren Geschwindigkeit der Rührplatte auf 350 Rpm einstellen.
Öffnen Sie dann den Hahn und schalten Sie die Pumpe bei 35 Rpm ein. Sobald der Lösungsgrad der Lichtfraktion niedriger als die schwere Fraktion ist, halten Sie die Pumpe an und öffnen Sie den Ventilstiel zwischen leichten und schweren Behältern. Lassen Sie die Fraktionen Volumen ausgleichen und starten Sie die Pumpe neu.
Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in das System gelangen und zwischen Glasplatten eingeklemmt werden. Sobald das Gradientengel vollständig gegossen ist, stoppen Sie die Pumpe und überlagern Sie ein Milliliter Wasser auf jedem Gel-Sandwich, um eine Trocknung des Gels zu verhindern. Lassen Sie es für zwei Stunden polymerisieren.
25 Milliliter Stapelgel in Erlenmeyerkolben zubereiten und wirbeln, um sie gründlich zu mischen. Um die Montage zart umzukehren, um Wasser zu entfernen, und legen Sie 15-Well-Kämme in jedes Gel-Sandwich ein. Stapelgel gießen und zwei Stunden polymerisieren lassen.
Danach Gel- und Sandwichklemmen einlegen und Denkamm entfernen. Mit der kurzen Glasplatte nach unten, legen Sie das Gel-Sandwich in den Kühlkern. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite und legen Sie den Kern in den Elektrophoresetank.
Gießen Sie 300 Milliliter blauer Kathodenpuffer in die Innenkammer des Elektrophoresetanks. Mit einer Pipette und Ladespitzen 75 bis 175 Mikrogramm Protein pro Brunnen laden. In einem kalten Raum bei vier Grad Celsius, stecken Sie die Elektroden in das Netzteil und schalten Sie es auf 150 Volt, und laufen Gel für eineinhalb Stunden, oder bis Proben alle in das Gradientengel eingegeben haben.
Lastreplikationen der Probe in separaten Brunnen, um eine parallele Bestimmung von In-Gel-Aktivitäten und Immunoblot-Analysen von OXPHOS-Komplexen zu ermöglichen. Entfernen Sie den blauen Kathodenpuffer mit Pipette. Ersetzen Sie durch 300 Milliliter Coomassie blau freien Kathodenpuffer, und laufen Gel bei 200 Volt über Nacht in kühlen Raum.
Vor dem Ende der Elektrophorese, bereiten In-Gel-Aktivitätspuffer nach dem Manuskript, und halten Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Elektrophorese und holen Sie Gel ab. Schneiden Sie die Plastiktüte, damit sie wie ein Buch geöffnet werden kann.
Schneiden Sie Fahrspuren und übertragen Gelspuren in Plastiktüten. Verwenden Sie einen Wärmeversiegeler, um zwei der drei Seiten zu versiegeln. Wenn Negativkontrollexperimente durchgeführt werden, fügen Sie den Assaypuffern Inhibitoren hinzu.
Fügen Sie für drei experimentelle Proben 20 Milliliter In-Gel-Aktivitätspuffer hinzu. Entfernen Sie Blasen und versiegeln Sie die vierte Seite der Plastiktüte. Inkubieren Gel Bahnen bei 37 Grad Celsius im Dunkeln und überprüfen Sie alle 15 Minuten.
Die Inkubationszeit variiert je nach Proteinmenge und Komplexen. Nach der Inkubation, Spülen Gel Spuren in Wasser, um Reaktion zu stoppen, und Bild auf einem weißen Hintergrund für komplex I, komplex II, komplex IV, oder schwarzen Hintergrund für komplexe V.Für dieses Beispiel wurde eine komplexe IV In-Gel-Aktivität durchgeführt, um Superkomplexe aus frischen Maus Leber mitochondrien isoliert zu visualisieren. Die optimale Menge an Digitonin für diese Probe beträgt vier Gramm pro Gramm, da es eine gute Auflösung von monomeren Komplex IV und hochmolekularen Superkomplexen bietet.
Bei einem niedrigeren Verhältnis sind Bänder nicht klar und lösen sich während der Elektrophorese in einen Abstrich auf, während die Verwendung eines höheren Digitonin-Verhältnisses zu einer Störung von Superkomplexen mit hohem Molekulargewicht führt. Lebermitochondrien, die von einer Maus isoliert wurden, wurden mit der optimalen Menge an Digitonin behandelt, um Atemsuperkomplexe zu extrahieren. Die elektrophoretische Mobilität von OXPHOS-Komplexen wird leicht reduziert, wenn Proteine unter Hybrid-Klar/Blau-Native-PAGE-Bedingungen getrennt werden, verglichen mit der standardmäßigen nativen PAGE, aufgrund der reduzierten Menge an Coomassie-Blau.
Diese Mobilitätsverschiebung ist größer für komplexe IV-Monomere, gefolgt von komplexen V-Monomeren und komplexen I.Der blaue Hintergrund ist im hybriden, klar nativen/blauen nativen PAGE niedriger als bei der blauen nativen PAGE. Hohe Hintergrundpegel nach blau nativer PAGE maskieren die In-Gel-Aktivitätsfärbung für Komplex II vollständig und verbessert das Hintergrundrauschen, das mit der Aktivität komplexer IV-Dimer verbunden ist. Für dieses Protokoll ist die Titration der von Interesse sindden Proben mit verschiedenen Mengen von Digitonin entscheidend, um die Bedingungen zu identifizieren, die eine optimale Löslichkeit ermöglichen, während die Enzymaktivität und physiologische Proteinwechselwirkungen erhalten bleiben.
Alle Schritte bezüglich des Gelgusses sollten sorgfältig durchgeführt werden, um einen optimalen Gradienten für eine ordnungsgemäße Probentrennung zu bilden. Auch bei der Manipulation dieser großen und zerbrechlichen Gele sollte äußerste Vorsicht geboten sein. Halten Sie sie immer mit mehreren Fingern mit dem hohen prozentualen Ende des Gels.
Bei dieser hybriden klar/blauen nativen PAGE-Methode werden Proben nur kurz dem anionischen Farbstoff Coomassie blue zu Beginn der Elektrophorese ausgesetzt, ohne dass andere Reinigungsmittel ausgesetzt werden. Dies ermöglicht es, Superkomplexe so effektiv wie bei herkömmlichen blauen nativen PAGE-Methoden zu trennen und zu lösen, während die negativen Auswirkungen von hohen Coomassie-Blauspiegeln auf In-Gel-Aktivitäts-Assays und labile Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb von Superkomplexen vermieden werden. Mit diesem Protokoll ist es daher möglich, präzise und schnelle In-Gel-Aktivitätsmessungen mit analytischen Techniken zu kombinieren, die 2D-Elektrophorese, Immundetektion und/oder Proteomik-Referenzanalyse von Superkomplexen beinhalten.
