Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Monash University, National Health und Medical Research Council und der Monash Lungen- und Schlaf Institut finanziert. Die Autoren möchten die Mitarbeiter der klinischen Immunologie an der Monash Gesundheit, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass und Camden Lo der Monash Micro Imaging (MMI) für Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie imaging danken, und die Autoren erkennen die MMI-Einrichtungen der Monash University. Die Autoren erkennen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung der Monash Histologie Plattform.

dieses Protokoll folgt Experimente in zugelassen: (1) Menschen von der Ethik Komitee der Monash Medical Center und (2) Tiere, die von der Ethikkommission der Universität Melbourne.
 1. alvéolaire Lavage (BAL) Makrophagen <ol><li>Verwendung BAL Lung Makrophagen in zu erhalten: (1) menschliche Themen durch Bronchoskopie 6 und (2) Mäuse mit Intra-trachealen streben 13 . 
	Hinweis: Erwerb von den Makrophagen führt in der Regel einige Aktivierung dieser Zellen. Makrophagen stammen aus Patienten, die erfordern eine Bronchoskopie, ein mögliches medizinisches Problem zu untersuchen und möglicherweise nicht alle Themen geeignet für die Analyse der METs (Dies müssen für jedes einzelne Projekt ermittelt werden).
	<ol><li>BAL Lösung und Spin-down (500 X g für 10 min.) in Form einer Tablette nehmen, waschen zweimal mit Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) mit fetalen Kälberserum 5 % und 1 % L-Glutamin) bei Raumtemperatur und verdünnen Sie Zellen in 4 mL Kultur medi Umm.</li>
		<li>Bei Bedarf anfordern eine formalen differenzielle Graf; die meisten Zellen (in der Regel &#62; 80 %) werden Makrophagen 6. 
		Hinweis: Dies wird in der Regel erfolgen durch einen klinischen Histologie-Service über die morphologische Darstellung der verschiedenen Zellen Typen 6.</li>
		<li>Führen eine tragfähige Makrophagen Zelle zählen auf die BAL-Lösung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und ein Hemocytometer. 
		Hinweis: BAL Lösung ergibt sich aus Mensch und Maus wie unter Schritt 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 Makrophagen zu 24-Well-Platten auf Deckgläsern in 500 µL Kulturmedium pro gut und lassen Sie über Nacht bei 37 ° C; die Zellen haften an den Deckgläsern. Fügen Sie für Humanproben, Antibiotika (z.B. Penicillin und Streptomycin, 10 4 U/mL), bakterielle Kontamination zu verhindern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunfluoreszenz Beschriftung/Mikroskopie von Makrophagen BAL Hinweis: Zellen auf Deckgläsern eingehalten werden, wie oben erwähnt.
<ol><li>Das Kulturmedium zu entfernen und waschen Sie die Zellen einmal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Beheben von Zellen in 2 % Paraformaldehyd/periodate/Lysin (PLP) Fixiermittel für 10 min.</li>
	<li>Zellen kurz in PBS waschen, und dann permeabilize in 0,2 % Tween 20 in PBS für 20 min.</li>
	<li>Block-Zellen mit 10 % Huhn Sera in 5 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt mit PBS-Puffer für 30 min.</li>
	<li>Inkubation mit Primär- und Isotype Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur in 1: 100-Konzentrationen (weitere Einzelheiten finden Sie in Tabelle of Materials) bei 37 ° c 
	Hinweis: Für die BAL-Proben, ein spezifische Marker von Makrophagen ist in der Regel nicht erforderlich.</li>
	<li>Nach der Zugabe von Primärantikörpern, waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, und weiter mit der entsprechenden Sekundärantikörper für 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-basierte Eindeckmittel zur Visualisierung mit einem confocal Mikroskop (siehe oben) am Laser Erregungen 405, 488, 561 und 647 nm und 40 X, 1,0 NA Öl Ziel.</li>
</ol> 3. Lunge Gewebeproben Hinweis: für in Vivo Studien von Lungengewebe, studieren die Proben nach der entsprechenden Exposition (z. B., wie beschrieben durch O &#39; Sullivan Et Al. 7). die Belichtung, die am besten für dieses Experiment sind infektiöse Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Maus-Stämmen, die für diese Methode verwendet werden könnten sind C57BL/6 oder BALB/c Mäuse, 10-12 Wochen alt, Gewicht 25-30 g und männlich.
<ol><li>Einschläfern Mäuse, über eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (400 mg/kg) und Xylazin (40 mg/kg). Öffnen der Brusthöhle und aussetzen von Lunge und Herz mit chirurgischen Pinzetten und Scheren.
	<ol><li>Einflößen warm PBS mit einer 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel zum Auswaschen des Blutes aus den Gefäßen für 30 s, dann die Infusion 10 mL 2 % PLP Fixativ für 30 s (in den rechten Ventrikel).</li>
		<li>Verwenden um Lavage der offenen Brustraum warm PBS (42 ° C). Intubation der Trachea mit einer 21-Gauge-Nadel und ein Stück 0,8 mm Schlauch geschnitten, und 800 µL vorgewärmten (bis 42 ° C) zu injizieren, niedrigschmelzende 3 % Agarose-Lösung zeigen.</li>
		<li>Tie abseits die Luftröhre mit geflochtenen Seide (4.0 USP). Legen Sie den Faden um die Luftröhre, knapp unterhalb der Einfügemarke an die Stelle der Kanüle, und sichern Sie sie über eine einfache Überhandknoten. Um die Agarose erstarren, eiskaltem PBS um die Lunge zu verwalten. Entfernen Sie die Lungen und das Herz als einen Block von der Brusthöhle mit Schere und stumpfe Dissektion. Jede Lunge einzeln entfernen und dann beheben sie für 16 h in 2 % PLP oder Formalin bei 4 ° c</li>
		<li>Speichern die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Gewebe zu schneiden. Diese Methoden für den Erhalt der Lungengewebe wurden zuvor beschriebenen 13.</li>
	</ol></li> <li>Zur Vorbereitung des Lungengewebes Beispiele verwenden die folgenden Schritte.
	<ol><li>Fix Lungengewebe Gewebe (reseziert im Schritt 3.1)-10 % natürlichen gepuffert Formalin für 24 h bei Raumtemperatur. Übertragen auf 75 % Ethanol und stellen in einem Gewebe-Prozessor auf einem 12 h Zyklus, (2,5 h in 75 % EtOH, 3 h in absolute EtOH, 3,5 h im Lösungsmittel 3 b und 3 h in Paraffin).</li>
		<li>Einbetten in standard Paraffin, Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Blöcke, die gespeichert sind bei Raumtemperatur zu schaffen. 
		Hinweis: In diesem Stadium ist es in der Regel zweckmäßig, die Lunge Querschnitte für standard Folien.</li>
		<li>Die Proteinkinase Lungen-Abschnitte bei 4-5 µm Dicke mit einem Mikrotom schneiden und montieren auf aufgeladen, beschichtete Folien wie oben beschrieben durch O &#39; Sullivan Et Al. 7</li> <li>, Folien zu montieren, 3 Tropfen Eindeckmittel auf Deckgläsern 60 mm x 24 mm (Größe 1,5), invertieren die Folie auf das Deckglas und push-out überschüssige Mittel. Hermetisch dichten mit Nagellack und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li></ol> 4. Vorbereitung/Mikroskopie von Gewebeproben Lunge <ol><li>de-einwachsen, rehydrieren und die Proteinkinase Lunge Gewebeprobe mit Antigen-Retrieval-Lösung vorbehandeln.
	<ol><li>Ofen trocken gleitet die Proteinkinase für 60 min bei 60 ° C. Dann legen Sie die Folien in Xylol Lösung für 30 min und den Transfer zu 70 % Ethanol Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Spülen in Leitungswasser.</li>
		<li>Ort in hitzebeständigen Folie eingeschweißt und unterliegt HIER-Antigen-Retrieval im Schnellkochtopf für 10 min in 10 m/Mol/L Tris, 1 Mmol/EDTA pH 9.0. Cool für 20 min. Waschen zweimal im Leitungswasser für 5 min auf einer Wippe, dann einmal mit PBS auf Rocker.</li>
		<li>Block mit 10 % Huhn Serum in 5 % BSA/PBS für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li> <li>Des Gewebes zu beflecken.
	<ol><li>, METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 1 % BSA/PBS 16 h bei 4 ° C in 1/100 Verdünnung (genauere Angaben zu Mengen Antikörper sind in Tabelle Materialien aufgeführt). Waschen zweimal mit PBS für 5 min auf einer Wippe.</li>
		<li>Erreichen-Fluoreszenz-Detektion durch Inkubation mit entsprechenden sekundären Antikörper in 1 % BSA/PBS für 40 min bei Raumtemperatur. Antikörper sind: (1) Huhn Anti-Maus 488 (grün), Huhn (2) Anti-Ziege 594 (rot) und (3) Esel Anti-Maus (weit rot) 647.</li>
		<li>Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-haltigen Eindeckmedium für das Chromatin beflecken.</li>
	</ol></li> <li>Fluoreszierenden Bilder mit einem konfokalen Laser-scanning-Kopf befestigt an einem inversen Mikroskop zu erhalten.
	<ol><li>Excite die Vorbereitung mit 405, 488, 561 und 647 nm Laser. Einziges Flugzeug 512 x 512 Pixel großen Bildern zu erfassen, durch Anklicken der Linie-sequentielle, Nivellierung Knopf (2 Zeile durchschnittlich) mit 20 X 0,1 NA Luft- und 40 X 1.0 NA Öl Ziele.</li>
		<li>Erhalten mindestens zehn Gesichtsfelder pro Abschnitt für Analysen und Daten für jedes Ergebnis (d.h. 10 Hochleistungs-FOV (HFOV) für das Steuerelement, 10 für die angeregten Probe, etc., für jede Maus). 
		Hinweis: Um eine repräsentative Stichprobe von das gesamte Feld zu erhalten, eine Matrixsystem kann verwendet werden in dem Bereich unterteilt ist in verschiedenen Abschnitten und für jede andere Probe die gleiche Matrix verwendet wird, um die Sichtfelder auswählen (z.B. Feld kann in 9 Abschnitte unterteilt werden, und das Zentrum und die 4 Ecken, zwei HFOV sind entnommen).</li>
	</ol></li></ol> 5. Dreidimensionale (3D) Imaging der METs Hinweis: da METs 3-d-Strukturen sind, indem man mehrere Z-Stapel Bilder, die wieder hergestellt werden, können geben wertvolle Informationen.
<ol><li>Abschnitt der Lunge Exemplare aus Paraffin-Blöcke bei 200 µm mit einem Vibratome bei einer Amplitude auf 1,8 mm und die Geschwindigkeit von 0,1-0,5 mm/s</li>
	<li>Blockieren Lungengewebe mit 20 % des jeweiligen Serum (10 % fetalen Kälberserum und 10 % Huhn Serum) und dann permeabilize in PBS ergänzt und 3,75 % Triton X 100 für 7 h bei Raumtemperatur unter sanften Agitation.</li>
	<li>Fleck in den Abschnitten 16 h bei 4 ° C mit der entsprechenden Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 200 µL Bände in Mikrozentrifugenröhrchen (Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle Materialien aufgeführt).</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in PBS, 3 Mal für 10 min vor der Inkubation mit sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	<li>Der Lunge Abschnitte für DAPI (1:5 000) in Lösung für 20 min, färben, bevor das Mikroskop schlüpft die Cover hinzufügen in PBS Folien.</li>
	<li>Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem inversen konfokalen Mikroskop (40 x 1.3 NA) ausgestattet mit 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm und 635 nm Laser.</li>
	<li>3-d-Z-Stapel von 0,54 µm Dicke mit optimalen Z-Schnitt für das 40 x 1.3 NA Öl Ziel aufnehmen. 
	Hinweis: Die verwendete Software variieren je nach dem individuellen Mikroskop. Ein Beispiel für die Verwendung der Software für ein Mikroskop erfolgt in ergänzende Datei 1.</li>
</ol> 6. Bildanalyse Hinweis: die Analyse der Proben erfordert den Einsatz von speziellen bildgebenden Analyse-Software und Beispiele sind in Tabelle Materialien aufgeführt. Während die Analyse der Ergebnisse abhängig von der spezifischen Programm verwendet wird, die unten aufgeführten Punkte sind wichtig.
<ol><li>Analyse von BAL-Proben <ol><li>definieren die Anzahl der Makrophagen durch den blauen Kanal für DAPI auswählen und zuweisen eine Mindestgröße für die Zellen (z.B., &#62; 18 µm im Durchmesser). Mit der entsprechenden Software, die Gesamtzahl der Makrophagen pro Feld messen.</li>
		<li>Die Anzahl der Zellen, die die Merkmale einer MET durch die Anwesenheit von extrazellulären Chromatin röntgenologisch DAPI mit Co Ausdruck von anderen Markern (z. B. MMP12, PAD2 und H3Cit). 
		Hinweis: Die Anzahl der Markierungen, die analysiert werden können hängt von der Anzahl der Laser zur Verfügung, sondern im Idealfall neben DAPI, sollten mindestens zwei andere Marker einbezogen werden. Andere, weniger spezifische Parameter für MET Ausdruck (z. B. Anzahl der Zellen mit extrazellulären Chromatin und einem erweiterten Kern) verwendet werden.</li>
		<li>MET Ausdruck in BAL vergleichen Proben (zwischen Kontrolle, Rauch und Rauch/DNase behandelt Gruppen), ein Minimum von 100 BAL Makrophagen pro Probe.</li>
		<li>Zur Messung Sekundärantikörper und Isotype Ebenen der Fluoreszenz zu kontrollieren, ein Minimum von 100 Zellen in jeder Probe für ihre Fluoreszenz zu messen. Messen Sie das durchschnittliche Niveau der Hintergrundfluoreszenz für jede Markierung (z.B. H3Cit) mit standard-Software.</li>
		<li>MET Ausdruck definieren zählen die Zellen mit den typischen Phänotyp (z. B. extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit und MMP9) und für jede MET, messen die Höhe der Fluoreszenz von Markern (z. B. H3Cit und MMP9). Zellen produzieren METs, wenn ihre Färbung nicht über Hintergrund und Isotype Kontrolle lag ausschließen.</li>
		<li>Für BAL Humanproben, analysieren Sie ein Minimum von 100 Zellen für jede Probe für den Anteil von Makrophagen, die METs zu machen. Für murinen Proben analysieren wie die Zellen kleiner sind und METs schwerer sind zu definieren, eine größere Anzahl von Zellen für jede Probe (z. B. 200 Makrophagen).</li>
	</ol></li> <li>Analyse von Gewebeproben Lunge <ol><li>verwenden um festzustellen, das Vorhandensein von METs im Lungengewebe spezifischen Makrophagen Marker wie F4/80.</li>
		<li>Definieren die Anwesenheit von METs in Lungengewebe mit Co Lokalisierung von F4/80 in Zellen, die extrazelluläre Chromatin mit anderen Parametern zu äußern, wie in Abschnitt 6.1 aufgeführt.</li>
		<li>Bestimmen den Umfang der Hintergrundfluoreszenz in Proben mit sekundären Antikörper und die Isotype-Steuerelemente. Analyse, die nicht über dem Hintergrund METs ausschließen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Angaben in Bezug auf diese Arbeit zu machen.

In diesem Beitrag beschriebene Methode basiert auf, die für die Definition der Präsenz der Netze14verwendet. Makrophagen sind bei weitem die dominierende Zelltyp in BAL-Proben und diese Methode der Sammlung eignet sich besonders für das Studium der METs. Wenn die roten Blutkörperchen in der BAL vorhanden sind, sollten diese Zellen lysiert werden, mithilfe von Ammoniumchlorid. Das BAL-Verfahren wird in der Regel die Makrophagen aktivieren und daher voraussichtlich werden METs in un-stimulierten Proben vorhanden. Die BAL-Makrophagen sind in der Regel sehr anhaftend. BAL-Makrophagen benötigen eine spezifische Markierung in der Regel nicht, da diese Zellen die dominierenden Zelltyp sind und auch durch ihre Morphologie unterschieden werden können. In der Regel in einem BAL, größer als 80 % der Zellen Makrophagen sind (und Neutrophilen weniger als 5 sind %), und nach mehreren Wäschen bleiben in der Regel nur die anhaftenden Leukozyten (d.h. die Makrophagen)6. Wenn es Zweifel über die Fähigkeit, Makrophagen von neutrophilen Granulozyten in Menschen zu unterscheiden, kann ein Neutrophilenzahl Marker wie Neutrophilen Elastase verwendet. Im Lungengewebe ist ein spezifische Makrophagen Marker (z.B.F4/80) erforderlich, da Makrophagen sind nur schwer von anderen Zelltypen unterscheiden. Makrophagen haben Auto-Fluoreszenz, so ist die Verwendung von Hintergrund und Isotype Steuerelementen wichtig; Dies ist insbesondere der Fall bei stimulierten Proben.
Der beste Weg, um das Vorhandensein von METs definieren bleibt bestimmt werden. Sind bestimmte Wege/Prozesse, die neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sind: (1) Granulat Proteasen, (2) Citrullination von Histonen und (3) PAD. PAD4 ist mehr spezifisch für Neutrophile, während PAD2 noch ausgeprägter in Monozyten/Makrophagen. Die Verwendung von F4/80 ist ein anerkannten Marker für murinen Makrophagen, aber menschliche Makrophagen haben keine solche wohldefinierte Marker und das kann Probleme darstellen, bei der Beurteilung der menschlichen Lungengewebe für MET Ausdruck. Analyse von MET Ausdruck im Lungengewebe kann schwieriger sein, da gibt es viele andere Zelltypen und die METs sind in der Regel auf die alveoläre Wände geschoben werden. Bei der Analyse der Gewebeschnitte werden METs am besten visualisiert, wenn sie flach im Querschnitt sind; Wenn die METs in einer anderen Ebene gibt, die es möglicherweise schwierig zu bestimmen, ob ein MET ist vorhanden. Dieses Problem kann in gewisser Weise angegangen werden, indem man Z-Stapel ermöglichen tiefere Gewebe (3D) Flugzeuge für die Prüfung von METs und das Potenzial, die METs in verschiedenen Aspekten zu visualisieren.
Es ist keine anerkannte Methode zum Definieren von des Vorhandensein von METs in Lunge Proben. Die beschriebenen Methoden basieren auf den zur Visualisierung von Netzen verwendet. Chow Et al. beschrieben durch die Anwesenheit von extrazellulären Chromatin15bewertet, dass die Mitogen PMA METs in einer Makrophagen-Zelllinie induziert. Eine weitere Studie zeigte, dass Mycobacterium Tuberculosis METs in-vitro- induzierte, definiert durch das Vorhandensein von extrazellulären Chromatin und H3Cit16. Wir haben in Vivo in einem Modell der Glomerulonephritis, gezeigt, dass METs in der Niere definiert durch Co lokalisierte Chromatin, Histon und Myeloperoxidase7vorhanden sind. Zu guter Letzt haben wir die Anwesenheit von METs in Vitro in der menschlichen Lunge Makrophagen durch die Kombination von extrazellulären Chromatin und MMP126gezeigt. Unsere Methode kann von anderen Forschern verwendet werden, um diese wichtige Facette der Entzündungsreaktion Forschung.
Es ist wahrscheinlich, dass die METs haben eine wichtige Rolle bei chronischen entzündlichen Erkrankungen erkannt werden. Die Prozesse, die zu NETosis führen, sind noch nicht gut definiert. Die Studie der METs kann bedeutende Einblicke in die Mechanismen der Falle Bildung liefern. Die Entwicklung von Protokollen mit mehr Markern und funktionelle Studien des METs werden weiter die Rolle der METs bei Krankheit definieren.
Es gibt wichtige Schritte, die wir in diesem Protokoll identifiziert haben. BAL-Humanproben dürften sekundäre bakterielle Kontamination und der Einsatz von Antibiotika in Kulturmedium ist wichtig für die Begrenzung der Verschmutzung. Die primären und sekundären Antikörper können in ihre Fluoreszenz, sogar mit dem gleichen Hersteller variieren. Zu guter Letzt die Analyse von Gewebeproben der Lunge ist komplexer als BAL-Proben und benötigt Zeit, um einen standardisierten Ansatz zu entwickeln.

Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs), wurden zuerst von Brinkmann Et Al. beschrieben 1 sie sind überwiegend als Reaktion auf die Infektion (vor allem Bakterien) hergestellt und haben eine wichtige Rolle im Host Verteidigung1,2. Sie sind auch beschrieben worden, um als Reaktion auf nicht-infektiösen Krankheiten, einschließlich Vaskulitis und systemischer Lupus erythematodes (SLE); und die Mitogen Phorbol 12-Myrisate 13-Acetat (PMA)2,3. Es ist vor kurzem erkannt worden, dass andere Zelltypen auch extrazelluläre fallen, einschließlich der Makrophagen produzieren können. Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) sind noch nicht definierte Entität in der Literatur4,5. Vor kurzem haben wir Methoden, um das Vorhandensein von METs in Vitro und in Vivo6,7. In diesem Artikel wird die Messung der METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beschrieben.
Hauptmerkmale der NETosis die Unterscheidung von anderen zellulären Wege (z. B. Apoptose8) sind die Extrusion von Chromatin in Verbindung mit: (1) Citrullination der Histone (H3Cit)9, (2) Co Ausdruck von Granulat Proteasen10 , und (3) Einbeziehung der Peptidyl Arginin Deiminase (PAD) 411,12. Makrophagen auch ausdrücken, H3Cit, Granulat Proteasen und PAD, und diese Funktionen können verwendet werden, um das Vorhandensein von METs zu definieren.
METs haben eine besonders wichtige Rolle in der Lunge, da die Makrophagen die dominante Zelle in die Alveolen und die Atemwege der Lunge vorhanden und die erste Rolle hat in der Leitung der zellulären Immunantwort auf Infektionen/Entzündungen. Darüber hinaus zwar ein Großteil der Lunge leeren Raum (z. B.innerhalb der Alveolen), sind die METs potenziell in der Lage, in den Raum zur Verfügung, im Gegensatz zu soliden Organe zu erweitern.
Die am weitesten verbreitete Methode, um das Vorhandensein von Netzen zu definieren ist von konfokalen Mikroskopie. Es gibt nicht noch eine klar definierte Methode zum Messen der METs. Die Technik für die Messung der Netze wurde angepasst um das Vorhandensein von METs in diesem Protokoll zu messen. Die wichtigsten Anforderungen für diese Methode sind Zugriff auf konfokalen Mikroskopie und entsprechende imaging-Software für die Analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human MMP12</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>NB110-57214</td>
			<td>1:100 concentration not quantifiable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MMP9</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>AB119906</td>
			<td>1:200 ascites, no concentration given</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB16478</td>
			<td>7 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NE</td>
			<td>LifeSpan Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse MMP9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AF909</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>In-house (hybridoma)</td>
			<td>In house</td>
			<td>20 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human &#173;&#173;&#173;&#173;PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-frost plus slides</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>S41104A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-prolong gold</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-goat AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>a-21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF 647</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>550878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1200 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue sources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>r8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent 3B</td>
			<td>Hi-Chem</td>
			<td>2026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 x 24 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c57 black 6</td>
			<td>Monash animal research platform (MARP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c</td>
			<td>MARP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Eine bevorzugte Methode verwendet, um das Vorhandensein von Neutrophilen extrazelluläre Traps (NETs) zu definieren ist konfokalen Mikroskopie. Wir haben etablierte konfokalen Mikroskopie Methoden zur Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) modifiziert. Diese extrazellulären fallen werden durch das Vorhandensein von extrazellulären Chromatin mit Co Ausdruck anderer Komponenten wie Granulat Proteasen, citrullinierte Histone und Peptidyl Arginase Deiminase (PAD) definiert. Der Ausdruck der METs in der Regel nach der Exposition auf einen Reiz gemessen und im Vergleich zu un-stimulierten Proben. Proben sind auch für Hintergrund und Isotype Kontrolle enthalten. Zellen werden mit genau definierten Bildanalyse-Software analysiert. Konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um das Vorhandensein von METs definieren sowohl in Vitro und in Vivo im Lungengewebe.

METs können von BAL-Proben, im Lungengewebe und in dickeren Bereiche der Lunge mit 3-d-Bildern sichtbar gemacht werden. Ein Beispiel der METs visualisiert in einer BAL-Probe ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der METs variiert je nach ihrem Stadium der Reifung. Die ersten nachweisbare Funktion auf Mikroskopie ist die Bewegung des Kerns an den Rand der Zelle. Dies folgt extrazelluläre Chromatin mit anderen Co ausgedrückten Mediatoren, wie H3Cit und Granulat Proteasen. In den früheren Stadien hat die Zelle immer noch etwa Kugelform mit der extrazellulären Falle zum Ausdruck gebracht. In einem späteren Stadium zeichnet sich die MET-Bildung durch Dehnung des Körpers der Zelle.
Lungengewebe sind METs in Abbildung 2dargestellt. Da die Lunge mit Flüssigkeit um die Lunge Architektur definieren aufgeblasen sind, werden die METs in der Regel gegen die alveoläre Wände geschoben werden. Die Morphologie der METs variieren auch je nachdem, welche Ebene des Gewebes in geschnitten wurde. Die Standardprofile für Lunge Gewebeproben verwendet werden 4 bis 5 µm Dicke. Dicker Gewebeschnitte ermöglichen mehrere Bilder zu treffenden und die METs können dann in 3D betrachtet werden. Der Antikörper werden nur so weit in das Lungengewebe eindringen und eine Dicke von 25-50 µm ist optimal. Ein Beispiel für ein 3D-Bild wird in Abbildung 3 und in Video 1angezeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
Abbildung 1: BAL METs. Menschlichen BAL METs gebildet nach der Stimulation in den verschiedenen Phasen der Entwicklung. METs waren gekennzeichnet durch extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit und MMP9. Färbung für Chromatin (A), (B) H3Cit, (C) MMP9 und (D) das zusammengefügte Bild. Panel-Einsätze sind Isotype Kontrollen. Skalieren von Balken = 10 µm (15 µm für Isotype). Frühzeitiger MET wird in der oberen rechten Ecke angezeigt und hat etwa Kugelform. Ein reifer MET wird in der Mitte des Feldes angezeigt. Bilder wurden mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und eine 40 x 1.0 NA Öl Ziel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Lungengewebe METs. Murine METs im Lungengewebe nach Stimulation. Die METs wurden durch extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit, MMP9 und F4/80 (als Makrophagen Marker) charakterisiert. (A) zeigt eine typische Hochleistungs-Sichtfeld verwendet, um die Anzahl der METs messen; Platten (B–F) zeigen die gestrichelte Fläche unter stärkerer Vergrößerung. Färbung für Chromatin (B), (C) H3Cit, (D) MMP9, F4/80 (E) und (F) das zusammengefügte Bild. Bedienfeld "einfügen" ist die Isotype-Kontrolle. Skalieren von Balken = 20 µm (20 µm für Isotype). METs sind in der Regel gegen die alveoläre Wände gedrückt. Bilder wurden mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und eine 40 x 1.3 NA Öl Ziel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
Abbildung 3: dreidimensionale Ansicht der Lunge Abschnitt. Maus Lungengewebe wurde behoben und in 25-35 µm dicke Abschnitte schneiden. Gewebe wurde mit Markern für METs beschriftet und mit Abschnitten bei 1 µm Dicke abgebildet. Bilder wurden mit einem Z-Stapel erstelle ich ein 3-dimensionales Bild von einer MET kombiniert. Bilder wurden mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und eine 40 x 1.3 NA Öl Ziel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
Video 1: dreidimensionale Ansicht der Lunge Abschnitt. Video entspricht Muster in Abbildung 3dargestellt. Achse Zecken = 5 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>

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Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Aufrufe.  Monash Medical Centre. Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Serie: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.