Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Monash University, National Health und Medical Research Council und der Monash Lungen- und Schlaf Institut finanziert. Die Autoren möchten die Mitarbeiter der klinischen Immunologie an der Monash Gesundheit, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass und Camden Lo der Monash Micro Imaging (MMI) für Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie imaging danken, und die Autoren erkennen die MMI-Einrichtungen der Monash University. Die Autoren erkennen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung der Monash Histologie Plattform.

dieses Protokoll folgt Experimente in zugelassen: (1) Menschen von der Ethik Komitee der Monash Medical Center und (2) Tiere, die von der Ethikkommission der Universität Melbourne.
 1. alvéolaire Lavage (BAL) Makrophagen <ol><li>Verwendung BAL Lung Makrophagen in zu erhalten: (1) menschliche Themen durch Bronchoskopie 6 und (2) Mäuse mit Intra-trachealen streben 13 . 
	Hinweis: Erwerb von den Makrophagen führt in der Regel einige Aktivierung dieser Zellen. Makrophagen stammen aus Patienten, die erfordern eine Bronchoskopie, ein mögliches medizinisches Problem zu untersuchen und möglicherweise nicht alle Themen geeignet für die Analyse der METs (Dies müssen für jedes einzelne Projekt ermittelt werden).
	<ol><li>BAL Lösung und Spin-down (500 X g für 10 min.) in Form einer Tablette nehmen, waschen zweimal mit Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) mit fetalen Kälberserum 5 % und 1 % L-Glutamin) bei Raumtemperatur und verdünnen Sie Zellen in 4 mL Kultur medi Umm.</li>
		<li>Bei Bedarf anfordern eine formalen differenzielle Graf; die meisten Zellen (in der Regel &#62; 80 %) werden Makrophagen 6. 
		Hinweis: Dies wird in der Regel erfolgen durch einen klinischen Histologie-Service über die morphologische Darstellung der verschiedenen Zellen Typen 6.</li>
		<li>Führen eine tragfähige Makrophagen Zelle zählen auf die BAL-Lösung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und ein Hemocytometer. 
		Hinweis: BAL Lösung ergibt sich aus Mensch und Maus wie unter Schritt 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 Makrophagen zu 24-Well-Platten auf Deckgläsern in 500 µL Kulturmedium pro gut und lassen Sie über Nacht bei 37 ° C; die Zellen haften an den Deckgläsern. Fügen Sie für Humanproben, Antibiotika (z.B. Penicillin und Streptomycin, 10 4 U/mL), bakterielle Kontamination zu verhindern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunfluoreszenz Beschriftung/Mikroskopie von Makrophagen BAL Hinweis: Zellen auf Deckgläsern eingehalten werden, wie oben erwähnt.
<ol><li>Das Kulturmedium zu entfernen und waschen Sie die Zellen einmal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Beheben von Zellen in 2 % Paraformaldehyd/periodate/Lysin (PLP) Fixiermittel für 10 min.</li>
	<li>Zellen kurz in PBS waschen, und dann permeabilize in 0,2 % Tween 20 in PBS für 20 min.</li>
	<li>Block-Zellen mit 10 % Huhn Sera in 5 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt mit PBS-Puffer für 30 min.</li>
	<li>Inkubation mit Primär- und Isotype Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur in 1: 100-Konzentrationen (weitere Einzelheiten finden Sie in Tabelle of Materials) bei 37 ° c 
	Hinweis: Für die BAL-Proben, ein spezifische Marker von Makrophagen ist in der Regel nicht erforderlich.</li>
	<li>Nach der Zugabe von Primärantikörpern, waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, und weiter mit der entsprechenden Sekundärantikörper für 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-basierte Eindeckmittel zur Visualisierung mit einem confocal Mikroskop (siehe oben) am Laser Erregungen 405, 488, 561 und 647 nm und 40 X, 1,0 NA Öl Ziel.</li>
</ol> 3. Lunge Gewebeproben Hinweis: für in Vivo Studien von Lungengewebe, studieren die Proben nach der entsprechenden Exposition (z. B., wie beschrieben durch O &#39; Sullivan Et Al. 7). die Belichtung, die am besten für dieses Experiment sind infektiöse Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Maus-Stämmen, die für diese Methode verwendet werden könnten sind C57BL/6 oder BALB/c Mäuse, 10-12 Wochen alt, Gewicht 25-30 g und männlich.
<ol><li>Einschläfern Mäuse, über eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (400 mg/kg) und Xylazin (40 mg/kg). Öffnen der Brusthöhle und aussetzen von Lunge und Herz mit chirurgischen Pinzetten und Scheren.
	<ol><li>Einflößen warm PBS mit einer 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel zum Auswaschen des Blutes aus den Gefäßen für 30 s, dann die Infusion 10 mL 2 % PLP Fixativ für 30 s (in den rechten Ventrikel).</li>
		<li>Verwenden um Lavage der offenen Brustraum warm PBS (42 ° C). Intubation der Trachea mit einer 21-Gauge-Nadel und ein Stück 0,8 mm Schlauch geschnitten, und 800 µL vorgewärmten (bis 42 ° C) zu injizieren, niedrigschmelzende 3 % Agarose-Lösung zeigen.</li>
		<li>Tie abseits die Luftröhre mit geflochtenen Seide (4.0 USP). Legen Sie den Faden um die Luftröhre, knapp unterhalb der Einfügemarke an die Stelle der Kanüle, und sichern Sie sie über eine einfache Überhandknoten. Um die Agarose erstarren, eiskaltem PBS um die Lunge zu verwalten. Entfernen Sie die Lungen und das Herz als einen Block von der Brusthöhle mit Schere und stumpfe Dissektion. Jede Lunge einzeln entfernen und dann beheben sie für 16 h in 2 % PLP oder Formalin bei 4 ° c</li>
		<li>Speichern die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Gewebe zu schneiden. Diese Methoden für den Erhalt der Lungengewebe wurden zuvor beschriebenen 13.</li>
	</ol></li> <li>Zur Vorbereitung des Lungengewebes Beispiele verwenden die folgenden Schritte.
	<ol><li>Fix Lungengewebe Gewebe (reseziert im Schritt 3.1)-10 % natürlichen gepuffert Formalin für 24 h bei Raumtemperatur. Übertragen auf 75 % Ethanol und stellen in einem Gewebe-Prozessor auf einem 12 h Zyklus, (2,5 h in 75 % EtOH, 3 h in absolute EtOH, 3,5 h im Lösungsmittel 3 b und 3 h in Paraffin).</li>
		<li>Einbetten in standard Paraffin, Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Blöcke, die gespeichert sind bei Raumtemperatur zu schaffen. 
		Hinweis: In diesem Stadium ist es in der Regel zweckmäßig, die Lunge Querschnitte für standard Folien.</li>
		<li>Die Proteinkinase Lungen-Abschnitte bei 4-5 µm Dicke mit einem Mikrotom schneiden und montieren auf aufgeladen, beschichtete Folien wie oben beschrieben durch O &#39; Sullivan Et Al. 7</li> <li>, Folien zu montieren, 3 Tropfen Eindeckmittel auf Deckgläsern 60 mm x 24 mm (Größe 1,5), invertieren die Folie auf das Deckglas und push-out überschüssige Mittel. Hermetisch dichten mit Nagellack und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li></ol> 4. Vorbereitung/Mikroskopie von Gewebeproben Lunge <ol><li>de-einwachsen, rehydrieren und die Proteinkinase Lunge Gewebeprobe mit Antigen-Retrieval-Lösung vorbehandeln.
	<ol><li>Ofen trocken gleitet die Proteinkinase für 60 min bei 60 ° C. Dann legen Sie die Folien in Xylol Lösung für 30 min und den Transfer zu 70 % Ethanol Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Spülen in Leitungswasser.</li>
		<li>Ort in hitzebeständigen Folie eingeschweißt und unterliegt HIER-Antigen-Retrieval im Schnellkochtopf für 10 min in 10 m/Mol/L Tris, 1 Mmol/EDTA pH 9.0. Cool für 20 min. Waschen zweimal im Leitungswasser für 5 min auf einer Wippe, dann einmal mit PBS auf Rocker.</li>
		<li>Block mit 10 % Huhn Serum in 5 % BSA/PBS für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li> <li>Des Gewebes zu beflecken.
	<ol><li>, METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 1 % BSA/PBS 16 h bei 4 ° C in 1/100 Verdünnung (genauere Angaben zu Mengen Antikörper sind in Tabelle Materialien aufgeführt). Waschen zweimal mit PBS für 5 min auf einer Wippe.</li>
		<li>Erreichen-Fluoreszenz-Detektion durch Inkubation mit entsprechenden sekundären Antikörper in 1 % BSA/PBS für 40 min bei Raumtemperatur. Antikörper sind: (1) Huhn Anti-Maus 488 (grün), Huhn (2) Anti-Ziege 594 (rot) und (3) Esel Anti-Maus (weit rot) 647.</li>
		<li>Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-haltigen Eindeckmedium für das Chromatin beflecken.</li>
	</ol></li> <li>Fluoreszierenden Bilder mit einem konfokalen Laser-scanning-Kopf befestigt an einem inversen Mikroskop zu erhalten.
	<ol><li>Excite die Vorbereitung mit 405, 488, 561 und 647 nm Laser. Einziges Flugzeug 512 x 512 Pixel großen Bildern zu erfassen, durch Anklicken der Linie-sequentielle, Nivellierung Knopf (2 Zeile durchschnittlich) mit 20 X 0,1 NA Luft- und 40 X 1.0 NA Öl Ziele.</li>
		<li>Erhalten mindestens zehn Gesichtsfelder pro Abschnitt für Analysen und Daten für jedes Ergebnis (d.h. 10 Hochleistungs-FOV (HFOV) für das Steuerelement, 10 für die angeregten Probe, etc., für jede Maus). 
		Hinweis: Um eine repräsentative Stichprobe von das gesamte Feld zu erhalten, eine Matrixsystem kann verwendet werden in dem Bereich unterteilt ist in verschiedenen Abschnitten und für jede andere Probe die gleiche Matrix verwendet wird, um die Sichtfelder auswählen (z.B. Feld kann in 9 Abschnitte unterteilt werden, und das Zentrum und die 4 Ecken, zwei HFOV sind entnommen).</li>
	</ol></li></ol> 5. Dreidimensionale (3D) Imaging der METs Hinweis: da METs 3-d-Strukturen sind, indem man mehrere Z-Stapel Bilder, die wieder hergestellt werden, können geben wertvolle Informationen.
<ol><li>Abschnitt der Lunge Exemplare aus Paraffin-Blöcke bei 200 µm mit einem Vibratome bei einer Amplitude auf 1,8 mm und die Geschwindigkeit von 0,1-0,5 mm/s</li>
	<li>Blockieren Lungengewebe mit 20 % des jeweiligen Serum (10 % fetalen Kälberserum und 10 % Huhn Serum) und dann permeabilize in PBS ergänzt und 3,75 % Triton X 100 für 7 h bei Raumtemperatur unter sanften Agitation.</li>
	<li>Fleck in den Abschnitten 16 h bei 4 ° C mit der entsprechenden Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 200 µL Bände in Mikrozentrifugenröhrchen (Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle Materialien aufgeführt).</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in PBS, 3 Mal für 10 min vor der Inkubation mit sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	<li>Der Lunge Abschnitte für DAPI (1:5 000) in Lösung für 20 min, färben, bevor das Mikroskop schlüpft die Cover hinzufügen in PBS Folien.</li>
	<li>Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem inversen konfokalen Mikroskop (40 x 1.3 NA) ausgestattet mit 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm und 635 nm Laser.</li>
	<li>3-d-Z-Stapel von 0,54 µm Dicke mit optimalen Z-Schnitt für das 40 x 1.3 NA Öl Ziel aufnehmen. 
	Hinweis: Die verwendete Software variieren je nach dem individuellen Mikroskop. Ein Beispiel für die Verwendung der Software für ein Mikroskop erfolgt in ergänzende Datei 1.</li>
</ol> 6. Bildanalyse Hinweis: die Analyse der Proben erfordert den Einsatz von speziellen bildgebenden Analyse-Software und Beispiele sind in Tabelle Materialien aufgeführt. Während die Analyse der Ergebnisse abhängig von der spezifischen Programm verwendet wird, die unten aufgeführten Punkte sind wichtig.
<ol><li>Analyse von BAL-Proben <ol><li>definieren die Anzahl der Makrophagen durch den blauen Kanal für DAPI auswählen und zuweisen eine Mindestgröße für die Zellen (z.B., &#62; 18 µm im Durchmesser). Mit der entsprechenden Software, die Gesamtzahl der Makrophagen pro Feld messen.</li>
		<li>Die Anzahl der Zellen, die die Merkmale einer MET durch die Anwesenheit von extrazellulären Chromatin röntgenologisch DAPI mit Co Ausdruck von anderen Markern (z. B. MMP12, PAD2 und H3Cit). 
		Hinweis: Die Anzahl der Markierungen, die analysiert werden können hängt von der Anzahl der Laser zur Verfügung, sondern im Idealfall neben DAPI, sollten mindestens zwei andere Marker einbezogen werden. Andere, weniger spezifische Parameter für MET Ausdruck (z. B. Anzahl der Zellen mit extrazellulären Chromatin und einem erweiterten Kern) verwendet werden.</li>
		<li>MET Ausdruck in BAL vergleichen Proben (zwischen Kontrolle, Rauch und Rauch/DNase behandelt Gruppen), ein Minimum von 100 BAL Makrophagen pro Probe.</li>
		<li>Zur Messung Sekundärantikörper und Isotype Ebenen der Fluoreszenz zu kontrollieren, ein Minimum von 100 Zellen in jeder Probe für ihre Fluoreszenz zu messen. Messen Sie das durchschnittliche Niveau der Hintergrundfluoreszenz für jede Markierung (z.B. H3Cit) mit standard-Software.</li>
		<li>MET Ausdruck definieren zählen die Zellen mit den typischen Phänotyp (z. B. extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit und MMP9) und für jede MET, messen die Höhe der Fluoreszenz von Markern (z. B. H3Cit und MMP9). Zellen produzieren METs, wenn ihre Färbung nicht über Hintergrund und Isotype Kontrolle lag ausschließen.</li>
		<li>Für BAL Humanproben, analysieren Sie ein Minimum von 100 Zellen für jede Probe für den Anteil von Makrophagen, die METs zu machen. Für murinen Proben analysieren wie die Zellen kleiner sind und METs schwerer sind zu definieren, eine größere Anzahl von Zellen für jede Probe (z. B. 200 Makrophagen).</li>
	</ol></li> <li>Analyse von Gewebeproben Lunge <ol><li>verwenden um festzustellen, das Vorhandensein von METs im Lungengewebe spezifischen Makrophagen Marker wie F4/80.</li>
		<li>Definieren die Anwesenheit von METs in Lungengewebe mit Co Lokalisierung von F4/80 in Zellen, die extrazelluläre Chromatin mit anderen Parametern zu äußern, wie in Abschnitt 6.1 aufgeführt.</li>
		<li>Bestimmen den Umfang der Hintergrundfluoreszenz in Proben mit sekundären Antikörper und die Isotype-Steuerelemente. Analyse, die nicht über dem Hintergrund METs ausschließen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Angaben in Bezug auf diese Arbeit zu machen.

In diesem Beitrag beschriebene Methode basiert auf, die für die Definition der Präsenz der Netze14verwendet. Makrophagen sind bei weitem die dominierende Zelltyp in BAL-Proben und diese Methode der Sammlung eignet sich besonders für das Studium der METs. Wenn die roten Blutkörperchen in der BAL vorhanden sind, sollten diese Zellen lysiert werden, mithilfe von Ammoniumchlorid. Das BAL-Verfahren wird in der Regel die Makrophagen aktivieren und daher voraussichtlich werden METs in un-stimulierten...

Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs), wurden zuerst von Brinkmann Et Al. beschrieben 1 sie sind überwiegend als Reaktion auf die Infektion (vor allem Bakterien) hergestellt und haben eine wichtige Rolle im Host Verteidigung1,2. Sie sind auch beschrieben worden, um als Reaktion auf nicht-infektiösen Krankheiten, einschließlich Vaskulitis und systemischer Lupus erythematodes (SLE); und die Mitogen Phorbol 12-Myrisate 13-Acetat (PMA)2,3. Es ist vor kurzem erkannt worden, dass andere Zelltypen auch extrazelluläre fallen, einschließlich der Makrophagen produzieren können. Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) sind noch nicht definierte Entität in der Literatur4,5. Vor kurzem haben wir Methoden, um das Vorhandensein von METs in Vitro und in Vivo6,7. In diesem Artikel wird die Messung der METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beschrieben.
Hauptmerkmale der NETosis die Unterscheidung von anderen zellulären Wege (z. B. Apoptose8) sind die Extrusion von Chromatin in Verbindung mit: (1) Citrullination der Histone (H3Cit)9, (2) Co Ausdruck von Granulat Proteasen10 , und (3) Einbeziehung der Peptidyl Arginin Deiminase (PAD) 411,12. Makrophagen auch ausdrücken, H3Cit, Granulat Proteasen und PAD, und diese Funktionen können verwendet werden, um das Vorhandensein von METs zu definieren.
METs haben eine besonders wichtige Rolle in der Lunge, da die Makrophagen die dominante Zelle in die Alveolen und die Atemwege der Lunge vorhanden und die erste Rolle hat in der Leitung der zellulären Immunantwort auf Infektionen/Entzündungen. Darüber hinaus zwar ein Großteil der Lunge leeren Raum (z. B.innerhalb der Alveolen), sind die METs potenziell in der Lage, in den Raum zur Verfügung, im Gegensatz zu soliden Organe zu erweitern.
Die am weitesten verbreitete Methode, um das Vorhandensein von Netzen zu definieren ist von konfokalen Mikroskopie. Es gibt nicht noch eine klar definierte Methode zum Messen der METs. Die Technik für die Messung der Netze wurde angepasst um das Vorhandensein von METs in diesem Protokoll zu messen. Die wichtigsten Anforderungen für diese Methode sind Zugriff auf konfokalen Mikroskopie und entsprechende imaging-Software für die Analyse.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Human samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 concentration not quantifiable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascites, no concentration given</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mouse samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slides</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotype control</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Sheep IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software Programs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Confocal scanning microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue sources&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natural formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 black 6</td><td>Monash animal research platform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Eine bevorzugte Methode verwendet, um das Vorhandensein von Neutrophilen extrazelluläre Traps (NETs) zu definieren ist konfokalen Mikroskopie. Wir haben etablierte konfokalen Mikroskopie Methoden zur Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) modifiziert. Diese extrazellulären fallen werden durch das Vorhandensein von extrazellulären Chromatin mit Co Ausdruck anderer Komponenten wie Granulat Proteasen, citrullinierte Histone und Peptidyl Arginase Deiminase (PAD) definiert. Der Ausdruck der METs in der Regel nach der Exposition auf einen Reiz gemessen und im Vergleich zu un-stimulierten Proben. Proben sind auch für Hintergrund und Isotype Kontrolle enthalten. Zellen werden mit genau definierten Bildanalyse-Software analysiert. Konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um das Vorhandensein von METs definieren sowohl in Vitro und in Vivo im Lungengewebe.

METs können von BAL-Proben, im Lungengewebe und in dickeren Bereiche der Lunge mit 3-d-Bildern sichtbar gemacht werden. Ein Beispiel der METs visualisiert in einer BAL-Probe ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der METs variiert je nach ihrem Stadium der Reifung. Die ersten nachweisbare Funktion auf Mikroskopie ist die Bewegung des Kerns an den Rand der Zelle. Dies folgt extrazelluläre Chromatin mit anderen Co ausgedrückten Mediatoren, wie H3Cit ...

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Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Aufrufe.  Monash Medical Centre. Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Serie: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Medizin

Färbung und Bildgebung zur Visualisierung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autor im Rampenlicht: Bildgebung extrazellulärer Neutrophilenfallen in Geweben von Mensch und Maus 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

Source: Zhang, Y., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60541">In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vitro stimulation of macrophage extracellular traps (METs) in human monocyte-derive macrophages using different inflammatory stimuli such as TNF-alpha, PMA, and HOCL. The video also demonstrates the method of SYTOX dye staining of METs for visualization.

In vitro Stimulation und Visualisierung von extrazellulären Makrophagenfallen

1. Polarization of HMDM

	Under sterile conditions, prepare the M1 priming media by adding interferon &#947; (IFN&#947;; 20 ng/mL) and lipopolysaccharide ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

Source: Sharma, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56459">Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the immunolabeling of macrophage extracellular traps, METs, in bronchoalveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid, and their visualization using a confocal microscope.

Visualisierung extrazellulärer Fallen in Makrophagen aus humanen bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) ...

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

In vitro Stimulation und Visualisierung von extrazellulären Makrophagenfallen

Visualisierung extrazellulärer Fallen in Makrophagen aus humanen bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten