NETs haben in jüngster Zeit Aufmerksamkeit erregt, aber die Quantifizierung von NETs in vivo hat sich als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll bietet eine wünschenswerte, hochempfindliche und wertvolle Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs im klinischen Umfeld. Diese Technik sollte erweitert werden, um den Schweregrad der Sepsis oder des septischen ARDS, des akuten Atemnotsyndroms, zu beurteilen.
Es ist allgemein anerkannt, dass die Regulierung von Dumps oder schadensassoziierten molekularen Mustern ein Schlüssel zur Verbesserung des klinischen Zustands der Sepsis ist. Der größte Vorteil dieser Methode ist die genaue Quantifizierung von zirkulierenden NET-Resten wie Myeloperoxidase-DNA und neutrophiler Elastase-DNA in kurzer Zeit. Es ist ratsam, die Proben vor dem Assay zu schleudern und wiederholtes Auftauen zu vermeiden.
Es ist wichtig, die im Protokoll angegebenen Inkubationszeiten einzuhalten. Beginnen Sie mit der Verdünnung frisch isolierter polymorphkerniger Neutrophiler auf 10.000 Zellen pro Milliliter in phenolrotfreiem RPMI 1640. In 35-Millimeter-Kulturschalen sieben.
Um neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs zu induzieren, stimulieren Sie zunächst die polymorphkernigen Neutrophilen mit 25 nanomolaren PMA. Dann werden die extrazellulären Fallen durch Zugabe von 0,6 Mikrogramm pro Milliliter DNase I teilweise verdaut und die Mischung 50 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Fügen Sie nun fünf-millimolares EDTA hinzu, um die DNase-Aktivität zu stoppen, und sammeln Sie das Medium, das die synthetisierten NETs enthält.
Zentrifugieren, um die Zelltrümmer zu entfernen. Sammle die Überstände von vier gesunden Kontrollen. Mischen Sie sie und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die weitere Verwendung.
Pipettieren Sie 100 Mikroliter verdünnte Antimyeloperoxidase mit 0,05 Mikrogramm des Antikörpers in eine ELISA-Platte. Decken Sie nun die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab, um die Verdunstung der Probe zu verhindern, und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, um die Bindung der Fängerantikörper zu ermöglichen. Am nächsten Tag wird die verdünnte Antikörperlösung aus den Vertiefungen entsorgt und 300 Mikroliter Waschlösung in jede Vertiefung pipettiert.
Klopfen Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken, um den überschüssigen PBS zu entfernen. Blockieren Sie jede Vertiefung der Platte mit 200 Mikrolitern des Sperrpuffers. Decken Sie es mit einer selbstklebenden Plastikabdeckung ab und verstopfen Sie die Vertiefungen, indem Sie es inkubieren.
Nachdem Sie die Blockierungslösung aus den Vertiefungen entsorgt und die Platte drei- bis viermal gewaschen haben, klopfen Sie sie auf einem Papiertuch trocken. Als nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter Plasma in alle Vertiefungen mit Ausnahme des Rohlings. Und verdünnen Sie es mit 75 Mikrolitern PBS, so dass das endgültige Well-Volumen 100 Mikroliter beträgt.
Geben Sie dann 100 Mikroliter PBS in die leere Vertiefung. Mischen Sie die Proben, indem Sie die Platte 10 Sekunden lang bei 250 U/min bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. Geben Sie zwei Mikroliter 100 voll verdünnte DNase I in alle Vertiefungen und legen Sie die versiegelte Platte 10 Sekunden lang auf den Schüttler, um die Proben gründlich zu mischen.
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie einen Mikroliter 0,5 molar EDTA in jede Vertiefung, um die DNase-Reaktion zu stoppen. Legen Sie dann die versiegelte Platte für 15 Sekunden auf den Schüttler, um die Proben gründlich zu mischen.
Zum Schluss wird die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert, damit sich die Proteinbausteine der NETs an die Fängerantikörper anlagern können. Am nächsten Tag entsorgen Sie die Lösung aus den Vertiefungen. Nach mehreren Well-Waschungen werden 100 Mikroliter des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-DNA-Detektionsantikörpers in jede Vertiefung pipettiert.
Die Platte 1 1/2 Stunden lang inkubieren und dann die Lösung in die Vertiefungen geben. Nach dem dreimaligen Waschen der Vertiefungen werden 100 Mikroliter ABTS-Substratlösung in jede Vertiefung pipettiert und die versiegelte Platte auf einem Schüttler im Dunkeln inkubiert. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter zweimolare Schwefelsäure hinzufügen.
Mischen Sie den Inhalt der Vertiefung, indem Sie vorsichtig auf die Tellerränder klopfen. Schließen Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader an den Computer an und starten Sie die Softwareanwendung. Erstellen Sie in der Statusleiste ein neues Experiment, und geben Sie ihm einen Namen.
Legen Sie dann die Parameter für das Ablesen der Platte fest, indem Sie Absorption als Lesetyp, Endpunkt als Lesemodus und zwei als Wellenlängen auswählen. Legen Sie als Nächstes Lambda eins auf 405 Nanometer und lambda zwei auf 490 Nanometer fest. Wählen Sie nun den Status "Aus" sowohl für "Automix" als auch für "Blanking" aus, während Sie die Option "AutoKalibrierung" auf "Ein" setzen.Wählen Sie dann unter "Streifen" die Option "Gesamte Platte lesen" aus.
Legen Sie abschließend die Wellenlängenpriorität der Spalte mit Normal als Wagengeschwindigkeit fest, und wählen Sie dann unter AutoRead die Option Aus aus. Legen Sie die Platte gut in die Instrumentenschublade und schließen Sie sie. Klicken Sie auf Lesen, damit die Platte sofort gelesen wird.
Lesen Sie die Absorption jedes Wells bei 405 Nanometern ab und führen Sie eine automatische Subtraktion der Absorption des Assaymediums von allen unbekannten Proben durch. Zuverlässige Standardkalibrierungskurven wurden sowohl für MPO-DNA als auch für NE-DNA erhalten, wenn die Absorptionswerte 0,93 bzw. 0,9 nicht überschritten. Die höchste OD wurde bei der Anwendung von 0,6 Mikrogramm pro Milliliter DNase I erzielt.
Die Inter-Assay-Variabilitätskoeffizienten für die Komplexe bei gesunden Kontrollen betrugen 1,871 bzw. 0,987, während die COVID-19-Patienten Variabilitätskoeffizienten von 2,532 bzw. 2,010 aufwiesen. Die mittleren Inter-Assay-Variabilitätskoeffizienten für MPO-DNA und NE-DNA betrugen 6,524 bzw. 4,389. Die Spezifität der Fängerantikörper gegenüber den MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen zeigte, dass die Isotyp-Kontrollantikörper wenig auf die Komplexe reagierten.
Der prozentuale Anteil beider Komplexe war im Plasma von Patienten mit COVID-19 höher als bei den gesunden Kontrollen. Die Verdauungszeit sollte optimiert werden, da sonst eine übermäßige Verdauung die Absorption verringert.
