Dieses Protokoll der Parafinisierung gefolgt von Antigen-Retrieval von Paraffin-eingebetteten Aortenschnitten kann ein nützliches Werkzeug sein, um die Rolle von neutrophilen trizellulären Fallen bei der Feinthrombose zu untersuchen. Der Nachweis von neutrophilen trizellulären Fallen durch Immunfluoreszenz in festem und paraffinintegriertem Gewebe ist konventionellen histologischen Stents wie HNE überlegen, da sie den gleichzeitigen Nachweis sicherer ERDNA und extrazellulärer Proteine ermöglichen. Dieses Protokoll kann in anderen Thrombentypen und in anderen Tierarten verwendet werden.
Die Identifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen innerhalb der katzenarteriellen Thromben deuten darauf hin, dass sie bei Derene eine Rolle bei der Thrombose bei Katzen spielen können. Die hier vorgestellten Protokolle sind Leitlinien. Wir empfehlen den Ermittlern dringend, die Dauer und die Bedingungen des Antigen-Rückholvorgangs anzupassen, um ein zufriedenstellendes Signal zu liefern.
Um ein automatisiertes System zur Deparaffinierung und Rehydrierung der Abschnitte auf Glasschlitten zu verwenden, legen Sie die Glasgletten in Regale. Drei Minuten lang vollständig in 100-prozentige Saline untertauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
Spülen Sie nicht zwischen den Schritten. Untertauchen Sie bei Raumtemperatur dreimal dreimal für jeweils drei Minuten vollständig in abnehmenden Ethanolkonzentrationen. Zwei Minuten lang vollständig in entionisiertes Wasser tauchen und noch einmal wiederholen.
Nach der Behandlung mit TBST füllen Sie das Reservoir mit entionisiertem Wasser, das auf 100 Grad Celsius erhitzt wird. Lassen Sie die Dampfkammer für 20 Minuten ausdemieren. Auf einer Wärmeplatte die handelsübliche Antigen-Retrievallösung mit Tris und EDTA bei pH 9,0 bis 95 bis 97 Grad Celsius erhitzen.
Stellen Sie sicher, dass es nicht kocht. Suberge die Gleitet vollständig in der beheizten Antigen-Retrieval-Lösung und setzen Sie den Einsatz der externen Heizung über den Dampfer für 20 Minuten. Als nächstes waschen Sie die Dias dreimal mit TBST für fünf Minuten.
Platzieren Sie nun die Abschnitte in Blockierpuffer 1. Zwei Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Schaukeln zwischen 30 und 50 U/min inkubieren. Ohne Waschen, sofort 100 Mikroliter verdünnter Kaninchen polyklonal anti-human citrullinierter Histon H3 Antikörper direkt auf die Rutsche auftragen.
Legen Sie auf jedem Abschnitt einen Abdeckzettel auf, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpergemischs zu ermöglichen. 12 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanftem Schaukeln bebrüten. Danach waschen Sie die Dias dreimal mit TBST für jeweils fünf Minuten.
Um Antikörper aufzutragen, verwenden Sie eine Pipette und verteilen Sie gleichmäßig 100 Mikroliter Ziegenanti-Kaninchen-Antikörper konjugiert alexa Fluor 488. Bedecken Sie die Dias mit Zinnfolie und bebrüten Sie die Dias eine Stunde bei Raumtemperatur unter sanftem Schaukeln. Nach dem Waschen mit TBST nach dem Manuskript, inkubieren die Abschnitte in Sperrpuffer 2 über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanftem Schaukeln.
Schützen Sie vor dem Licht. Waschen Sie mit TBST dreimal für jeweils fünf Minuten. Blockieren Sie die Abschnitte im Sperrpuffer 3 wie bisher bei Raumtemperatur für zwei Stunden unter sanftem Schaukeln.
Inkubieren Sie die Abschnitte mit Biotin laded ployclonal Kaninchen anti-human entrophil elastase Antikörper bei vier Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden, wie zuvor beschrieben. Nach dem Waschen mit TBST inkubieren die Rutschen mit Alexa Fluor 594 Streptavidin Konjugat für eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach einmal fünf Minuten mit TBST waschen.
100 Mikroliter Autofluoreszense Quenching Lösungsmischung direkt auf die Abschnitte für eine Minute, wie vom Hersteller angewiesen. Waschen Sie die Dias sofort sechsmal für jeweils 10 Minuten mit TBST. Bedecken Sie jeden Schlitten mit 100 Mikrolitern 300 Nanomolar DAPI für fünf Minuten im Dunkeln.
Dann mit TBST fünfmal für jeweils drei Minuten waschen. Tragen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium direkt auf die Glasrutsche auf, die den Abschnitt umgibt. Legen Sie einen Deckelschlupf sanft auf den Abschnitt, ohne Blasen zu erzeugen.
Lassen Sie die Proben über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius aushärten. Um Thrombi zu lokalisieren, scannen Sie kranially zu kauarisch entlang der Länge der Aorta, Aortenbifurkation und jeder femeralen Arterie mit Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fachen Objektiv. Untersuchen Sie zunächst die Abschnitte auf zellfreie DNA mit dem DAPI-Kanal mit der Anregung bei 357 und 44 Nanometern.
Identifizieren Sie extrazelluläre neutrophile Elastase und citrullinierte Histon H3 auf den texanischen roten und grünen fluoreszierenden Proteinkanälen. Halten Sie konsistente Belichtungszeit und Gewinne jedes Kanals während der gesamten Aufnahme von Bildern aufrecht, um eine Sättigung der Pixelintensität zu vermeiden. Neutrophile extrazelluläre Fallen werden identifiziert, basierende Kolokalisierung von neutrophiler Elastase, citrulliniertem Histon H3 und zellfreier DNA.
Mit Hämatoxylin- und Eosinflecken und Hellfeldmikroskopie bestehen Katzenarterienthromben aus roten Blutkörperchen, Leukozyten, Fibrin und Blutplättchen. NETs erschienen als Netzwerke von tiefvioletten Fäden verschiedener Längen, die nahegelegene Erythrozyten und Leukozyten umgaben. Mit diesem Protokoll ergab die Immunfluoreszenzmikroskopie große Aggregate von NETs, die aus zellfreier DNA, extrazellulärzitrulliniertem Histon H3 und neutrophiler Elastase bestehen.
Unter Phasenkontrast in der Immunmikroskopie wurde ein Thrombus als gut abgegrenzte Struktur im Gefäßraum charakterisiert. Thromben wurden jedoch in keiner der Kontrollproben nachgewiesen. Diese Abbildung zeigt eine tiefe Autofluoreszenz von Gerinnselelementen wie Erythrozyten, wenn sie bei der Wellenlänge von 488 Nanometern abgebildet werden.
Kurze Autofluoresenabschreckung nach Derimmunodierung erhöhte die Empfindlichkeit von Protein-Co-Lokalisierung und NET-Nachweis auch in Gebieten mit einer Fülle von Erythrozyten signifikant. Die Dauer der Fixierung wirkt sich auf die Immunreaktivität bestimmter Antigene aus. Wir empfehlen eine Fixierung für nicht länger als 24 Stunden par die Dehydrierung und Paraffineinbettung.
Alternativ kann methanolfreies Paraformaldehyd verwendet werden, um Artefakt durch Ameisensäure und Ketone durch Oxidation von Formaldehyd zu begrenzen. Um Interferenzen bei der Verwendung von Primärantikörpern derselben Spezies zu vermeiden, haben wir einen zusätzlichen Sperrschritt zur Sättigung aller verbleibenden Bindungsstellen an den sekundären Antikörpern aufgenommen. Die Forscher müssen Negativkontrollen umfassen, die aus Isotyp-Antikörpern, dem Ausschluss von Primärantikörpern und Immun-Labeling-Schritten und biologischen Kontrollen von Katzen ohne Thrombose bestehen.
Die Autofluoreszenz von Gewebegrenzen von Thromben kann die mikroskopische Identifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen hämmern. Der Prüfer kann die Fluoreszenz durch den Einsatz von weitroten Fluorophoren minimieren. Diese Technik kann ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von neutrophilen extrazellulären Fallen in anderen Tierarten sein.
Dies kann ein besseres Verständnis der Pathophysiologie der Thrombose bieten.
