Dieses Protokoll zeigt die Heterogenität in Zusammensetzung, Struktur und Morphologie von neutrophilen extrazellulären Fallen, abhängig von ihrem induzierenden Reiz unter vergleichbaren In-vitro-Bedingungen in humanen Neutrophilen von gesunden Individuen. Es wird eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit der neutrophilen Granulozyten erreicht. Dies ermöglicht es, die Konzentration von DNA, LL-37 und die Enzymaktivität von Myeloperoxidase, Elastase und Cathepsin G zu vergleichen, die von extrazellulären Neutrophilenfallen freigesetzt werden.
Dieses Protokoll ermöglichte es, die Wirkung von löslichen Faktoren oder Zellkontakt oder mögliche Therapien oder Mechanismen zum Schließen der Produktion von NETs bei Autoimmunerkrankungen zu analysieren. Diese Methoden können bei der Untersuchung von Autoimmunerkrankungen helfen. Aufgrund der unkontrollierten Zellvermehrung von NETs und der Dauer der Ausrichtung ihrer Bestandteile, die als Biomarker der Krankheit gelten.
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Bilder von NETs aufzunehmen, die die Dispersion von DNA in Verbindung mit Proteinen wie LL37 zeigen, die mit Mikroorganismen kolokalisiert sind, um zu verstehen, wie sie aussehen. Führen Sie zunächst eine Venenpunktion durch, um 10 Milliliter peripheres Blut in Röhrchen zu sammeln, die Dikalium-EDTA als Antikoagulans enthalten. Führen Sie dann eine Standard-Blutbiometrie und einen C-reaktiven Proteintest durch, um eine Infektion oder Entzündung auszuschließen und die Qualität der Probe sicherzustellen.
Zentrifugieren Sie die periphere Blutprobe, um das plättchenreiche Plasma zu entfernen, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation und verwerfen Sie das verbleibende Plasma. Verdünnen Sie das resultierende Erythrozyten- und Leukozytenpaket im Eins-zu-Eins-Volumenverhältnis mit einem 1X DPBS. Dann geben Sie in einem sterilen 10-Milliliter-Glasröhrchen zuerst einen Milliliter mit 1,08 Gramm pro Milliliter Dichtelösung, gefolgt von einem Milliliter mit 1,079 Gramm pro Milliliter Dichtelösung.
Dann fügen Sie vier Milliliter des verdünnten Erythrozyten- und Leukozytenpakets hinzu, indem Sie es über die Wände gießen. Zentrifuge ohne Beschleunigung oder Verzögerung, um das Gefälle nicht zu stören. Die Phase, die den Granulozyten entspricht, wird abgesaugt und in ein anderes steriles 10-Milliliter-Glasröhrchen überführt.
Mit vier Millilitern 1X DPBS bei 300 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius waschen und den Überstand entsorgen. Um die verbleibenden Erythrozyten zu entfernen, behandeln Sie die Zellen mit einem osmotischen Schock, indem Sie vier Milliliter 0,2% Kochsalzlösung hinzufügen. Zwei Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren und zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie vier Milliliter 0,65% Kochsalzlösung hinzu. Fünf Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, um die Integrität der Membran wiederherzustellen und die Zentrifugation zu wiederholen. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern 1X DPBS, um Zelltrümmer zu entfernen.
Zentrifugieren Sie das Zellpellet erneut und suspendieren Sie es erneut in zwei Milliliter kaltem HBSS-Puffer. Um einen Trypanblau-Ausschlusstest durchzuführen, verdünnen Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension in 20 Mikrolitern 0,4% Trypanblau. Zählen Sie die Zellen in einer neuen Laubenkammer und bestimmen Sie die Zelllebensfähigkeit mit einem Ausschlusstest.
Dann montieren Sie 5 Mikroliter der Zellsuspension auf einem Objektträger und färben Sie 15 Sekunden lang mit Wright-Färbung. Fixieren Sie die Probe sofort, waschen Sie sie mit destilliertem Wasser und beobachten Sie die Morphologie unter einem optischen Mikroskop. Als nächstes geben Sie einmal 10 bis fünf Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen und färben Sie mit einem Mikroliter 7AAD in 100 Mikroliter FACS-Puffer für 15 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Mit 500 Mikroliter FACS-Puffer bei 300 g 10 Minuten waschen. Fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Durchflusszytometrie-Analyse. Für eine tote Zelle fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten und waschen Sie mit 500 Mikrolitern 1XPBS bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter 0,1% Triton X-100 hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius. Mit 500 Mikrolitern 1X PBS waschen und mit 7AAD einfärben.
Analysieren Sie die erfassten Daten in der Durchflusszytometer-Software. Laden Sie die Dateien und doppelklicken Sie auf die ungefärbte Neutrophilendatei. Wählen Sie Vorwärtsstreuung oder FSC auf der X-Achse und Seitenstreuung oder SSC auf der Y-Achse, um die Zellpopulation anzuzeigen, die den Neutrophilen entspricht.
Wählen Sie dann den Kanal B3-A:PerCP vio 700-A auf der X-Achse, um die Autofluoreszenz der Zellen zu begrenzen und wählen Sie das Histogramm auf der Y-Achse. Öffnen Sie dann die gefärbte Neutrophilendatei. Wählen Sie FSC auf der X-Achse und SSC auf der Y-Achse, um die Zellpopulation anzuzeigen, die den Neutrophilen entspricht.
Wählen Sie erneut den Kanal B3-A:PerCP vio 700-A, um die Population der Neutrophilen abzugrenzen, die für den Farbstoff 7AAD positiv sind. Generieren Sie das endgültige Histogramm, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster klicken und In Layout-Editor kopieren auswählen. Geben Sie bakterielle oder pilzliche Pseudohyphen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen hinzu.
Fügen Sie 200 Mikroliter hinzu, also fünf mikromolare CFSC in 1X PBS. Mischen und bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten im Dunkeln inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 500 Mikroliter dekomplementäres Plasma und Zentrifuge hinzufügen.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 1XPBS durch Zentrifugation. Dann suspendieren Sie die Mikroorganismen in 250 Mikrolitern 1X PBS. Bereiten Sie 50 Mikroliter-Aliquots in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit zweimal 10 bis zum siebten Bakterium oder zweimal 10 bis zum fünften Pseudohyphen für die NET-Induktion vor.
Legen Sie 10 x 10 Millimeter große sterile Glasabdeckungen in eine 24-Well-Platte. Mit 10 Mikrolitern 0,001%Poly-L-Lysin für eine Stunde bei Raumtemperatur bedecken und zweimal mit 100 Mikrolitern 1X PBS waschen. An der Luft trocknen und 15 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.
Als nächstes wird die HBSS-Lösung der zuvor hergestellten neutrophilen Suspension durch RPMI 1640-Medium ersetzt, das mit 10% wärmedekomplementärem autologen Plasma ergänzt wird. Fügen Sie 350 Mikroliter dieser Zellsuspension zu der 24-Well-Platte hinzu, um eine Endkonzentration von zwei mal 10 bis zur fünften Neutrophile pro Vertiefung zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, damit die Zellen am Boden der Vertiefungen haften bleiben.
Um die Netzbildung zu induzieren, fügen Sie die Bakterienreize MOI100 und Pseudohyphen an MOI1 hinzu. Fügen Sie auch die biochemischen Stimuli hinzu und bereiten Sie eine Kontrolle ohne Stimulus vor, indem Sie 50 Mikroliter HBSS hinzufügen. Erhalten Sie ein Endvolumen von 400 Mikrolitern pro Vertiefung und mischen Sie auf einem Plattenschüttler bei 140 U/min für 30 Sekunden.
Dann vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Nach der Nettoinduktion wird der Überstand durch vorsichtiges Pipettieren aus den Vertiefungen entfernt und die Zellen 30 Minuten lang mit 300 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd fixiert. Waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 1X PBS ohne Zentrifugieren und fügen Sie 200 Mikroliter Blockpuffer für 30 Minuten hinzu.
Für die LL37-Färbung permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,2% Triton X-100 in 1X PBS für 10 Minuten und waschen Sie zweimal mit 1X PBS. Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträgern. DNA färbt die Zellen mit zwei Mikrolitern DAPI und lagert sie bei minus 20 Grad Celsius bis zur Analyse durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie.
Die dynamischen zellulären Phasen wurden nach doppelter Dichtegradientenreinigung visualisiert. Die typische Morphologie der neutrophilen Granulozyten wurde durch eine rechte Färbung bestätigt. Die Zellen zeigten auch eine optimale Lebensfähigkeit, die durch Trypanblau-Ausschluss ohne Membranzerstörung beobachtet wurde.
Die Analyse von SSC versus FSC mittels Durchflusszytometrie bestätigte eine PMN-konforme Population mit hoher Zellreinheit. PMN-Punktdiagramme für ungefärbte Zellen im Vergleich zu 7AAD-Färbungszellen und ihre jeweiligen Histogramme zeigten eine hohe Zelllebensfähigkeit in den frisch isolierten Neutrophilen im Vergleich zu den permeabilisierten Kontrollzellen. Nach der Stimulation der Neutrophilen mit chemischen und mikrobiellen Stimulanzien wurden NETs durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von DNA-DPI und Anti-LL37 sichtbar gemacht.
Die Mikroorganismen wurden mit CFSE vorgefärbt. PMA-induzierte suizidale Netzbildung, indiziert durch Kolokalisation mit LL37. Während NETs, die mit HOCI gebildet wurden, eine geringe DNA-Dispersion im extrazellulären Raum zeigten, die der vitalen NET-Bildung entsprach.
NET, das durch pilzliche Pseudohyphen induziert wurde, zeigte niedrige Konzentrationen von DNA, die in den extrazellulären Raum freigesetzt wurden, mit filamentösen Strukturen, die für die vitale NET-Bildung charakteristisch sind. S. aureus zeigte eine vitale NET-Bildung, während P. aeruginosa die Freisetzung großer DNA-Konzentrationen mit einer trüben Morphologie induzierte, die mit LL37 kolokalisiert war, was auf eine Selbstmord-NET-Bildung hindeutet. Die Durchführung der Doppeldichtegradientenmethode ermöglicht es uns, eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit von Neutrophilen zu erreichen.
Und wir heben die Waschungen an, wir vermeiden es, die Struktur von ihnen zu beschädigen. Mit dieser Methode können wir die Wirkung von Substanzen oder Zellen auf die NET-Produktion analysieren, sowie ob sie an einem Mechanismus beteiligt sind oder ob sie als Therapie bei Autoimmunerkrankungen verwendet werden.
