The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + Töten Auswahl <ol><li> Zelllinien <ol><li> Stabil zu transfizieren NHE-defiziente Zellen (zB die CCL39-abgeleitete PS120 Zellinie 16) mit einer beliebigen Kombination von Säugetier-Expressionsvektor und Transfektion Verfahren, die eine effiziente Transfektion Ausbeuten und Selektion in einer Fibroblastenzelllinie zu produzieren. HINWEIS: Viele Jahre wurde Calciumphosphatpräzipitation 19 mit guten Ausbeuten Transfektion verwendet. Dies wurde in jüngerer Zeit durch kommerzielle Reagenzien wie Lipofectamine2000 ersetzt, wobei die Transfektionen nach Herstellerangaben durchgeführt. </li></ol></li><li> Lösungen <ol><li> Bereiten drei nachstehend beschriebenen sterilen Lösungen. Sterilisieren Sie diese Lösungen durch Filtration (0,22 um). <ol><li> Vorbereiten einer NH 4 + Loading-Lösung (pH 7,4) von 50 mM NH 4 Cl, 70 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM gl umfasstucose und 15 mM MOPS pH 7,4. </li><li> Bereiten einer Spüllösung (pH 7,0), der 120 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,0 enthielt. </li><li> Vorbereiten einer Gewinnungslösung (pH 7,4), der 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 enthielt. </li></ol></li></ol></li><li> Vor Beginn der Auswahl, erhalten eine Zellkulturbrutschrank, die bei 37 ° C ohne zusätzliche CO 2 aus externem Behälter (genannt CO 2 - &quot;frei&quot; Inkubator) verwendet werden kann, wie 5% CO 2 wird in Puffer Ergebnis, dass die beeinträchtigen können Versauerung. Erhöhen der Zelllinie, die NHE von Interesse bis zu etwa 2 x 10 8 Zellen (in der Regel etwa 20 konfluenten 100 mm-Platten). </li><li> H + Töten Verfahren: <ol><li> Die Zellen, die den intrazellulären NHE interessiere Inkubation für 1 Stunde in der Auftragslösung bei 37 ° C im CO 2 -freie Inkubator. </li><li> Saugen Sie das Lade Lösung und dann zweimal spülen Sie sie in der oben beschriebenen-Spüllösung. Führen Sie diesen Schritt effizient, um die restliche extrazellulären NH 4 Cl, die die Schaffung eines steilen NH 4 + Gradienten, die die Versauerung generieren beeinträchtigen beseitigen. </li><li> Beseitigen Sie die Spülmedium durch Aspiration und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde im Recovery-Lösung wieder auf 37 ° C im CO 2 Inkubator frei. </li><li> Ersetzen des Wiederherstellungsmedium mit regelmäßigen Kulturmedium (typischerweise DMEM mit 7,5% FCS) und wachsen die Zellen in Standardkulturbedingungen (37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 und 95% Luft). </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diesen Zyklus der Auswahl zweimal in der Woche, bis stabile Klone entstehen. HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig über die Zellkultur und Selektionsbedingungen. Monate Arbeit kann von jedem Kontamination, die anfälliger für o ist ruiniertCCur nach einer langen Periode der Kultur und wiederholte Zellmanipulationen. <ol><li> Hier auswählen, ob die Klone zu verstärken und zu charakterisieren, sie individuell, wie weiter in Abschnitte 2-3 beschrieben, oder sie gemeinsam zusammen, um eine Zellpopulation vor der Charakterisierung zu erzeugen. </li></ol></li><li> Anwenden gelegentlichen Auswahl (etwa einmal alle zwei Wochen), um die Ansäuerung-resistenten Zellen durch Gegen diejenigen ausgewählt werden, die dem Elternsäureempfindlichen Phänotyp (1B) umgeschaltet haben kann beibehalten. </li></ol> 2. Intrazelluläre pH-Messungen 2.1) Fluoreszenz pH Imaging <ol><li> Verwenden Sie die ratiometrische pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF / AM, der pH-empfindlich ist, wenn bei 490 nm angeregt und besitzt eine 445 nm isosbestischen Punkt nach Herstellerprotokolle. <ol><li> Alternativ können Sie auch andere pH-empfindliche Sonden, nach Herstellerprotokolle. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine Bild gesetzt conbestehend aus einem umgekehrten Mikroskop auf eine hohe Empfindlichkeit Videokamera gekoppelt ist. Rüsten Sie dieses Set mit 450 nm und 490 nm Schmalband-Interferenzfilter, gepaart mit entsprechenden Quarz-Neutraldichtefilter zur Anregung. <ol><li> Wenn möglich, verwenden Sie die entsprechende Reihe von Filtern und Beleuchtungsbedingungen die Einrichtung vergleichbarer Fluoreszenzwerte für λ1 und λ2, dass das Verhältnis nähert 1. Vermeiden Sie auch basale Fluoreszenzwerte, die gesetzt werden, entweder gesättigt oder zu niedrig ist, sowohl für λ1 und / oder λ2. Dies kann wichtige Artefakte ergeben, wie dann kann das Verhältnis nicht nachweisbar, obwohl intrazellulären pH-Wert verändert sich. HINWEIS: Das System muss schnell Perfusion, Zeitraffer-Anregung bei den beiden oben genannten Wellenlängen und Übernahmen in der richtigen Emissionswellenlänge (535 nm für BCECF) zu ermöglichen. Rüsten Sie das System mit Software, die automatische Datenerfassung und -speicherung. </li></ol></li></ol> 2.2) Messung der NHE Zukunfts Aktivität (Extrusion vonProtonen aus dem Cytosol) <ol><li> Anzusäuern Zellen durch einen 1-stündigen Inkubation in der NH 4 + Loading-Lösung (siehe Schritt 1.4) in Abwesenheit von CO 2. </li><li> Fügen BCECF-AM (5 uM Endkonzentration) zu der Lösung in den letzten fünf Minuten und dann spülen Sie ihn mit NH 4 + Beladungslösung, die extrazelluläre Sonde zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. Versorgen die Spüllösung (siehe oben). Dies führt zu einem Abfall der Fluoreszenz, die der Ansäuerung. </li><li> Nach pH-Stabilisierung, durchströmen eine der unten angegebenen Lösungen für pH Rückgewinnungsraten von Li + / H +, Na + / H + oder K + / H + Austausch vermittelte messen. Jede Lösung enthält eine potentielle Kopplung Kation für H + Austausch getestet werden. Wenn eine dieser transportiert wird, wird dies in einer Zunahme der Fluoreszenz bei 495 nm, die entspr resultierenond zu einer Erhöhung des intrazellulären pH-Wert: 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, 125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, </li></ol> 2.3) Messung der NHE Rückwärtsaktivitäts ANMERKUNG: Das Prinzip dabei ist, die Transmembran-Ionengradienten invertieren. <ol><li> Vor der Messung laden die Zellen mit der intrazelluläre Kation von Interesse (siehe unten). </li><li> Inkubieren Sie sie für 5 min mit BCECF / AM (siehe Schritt 2.2.2); spülen Sie sie, hängen Sie sie auf dem Videomikroskop. </li><li> Versorgen die Beladungslösung an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. </li><li> Nach der Grundlinienstabilisierung Bild die pH-Schwankungen, wenn die Zellen mit einer extrazellulären sauren Medium, das 120 m perfundiertM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM MES bei pH 6,5. </li><li> Für LiCl Lade inkubieren Zellen für 2 h in einer Lösung von 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt. Intrazellulärem Lithium durch Atomabsorptionsspektroskopie gemessen ergibt einen Wert von etwa 60 mM. </li><li> Für Na + Lade inkubieren Zellen für zwei Stunden in einer Lösung aus 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt ist, in Gegenwart von 1 mM Ouabain die Na / K-ATPase zu blockieren. Unter diesen Bedingungen ist die intrazelluläre Na + Konzentration im Bereich von 40 mM. HINWEIS: K + Belasten nicht notwendig cytosolischen K + -Konzentration in einem Bereich von 140 mm und einen nach außen gerichteten K + -Gradienten ist daher leicht zu erreichen. </li></ol> 2.4) Datenreinigung und Kalibrierung: HINWEIS: Dieser Schritt gilt sowohl für die Vorwärts- und Rückwärtsmessung. <ol><li> Am Ende jedes Experiments perfundieren Zellen mit einer Lösung von 140 mM KCl, 20 mM HEPES und 5 &amp; mgr; M Nigericin auf pH-Werte zwischen 6,5 und 7,4 eingestellt. </li><li> Sammeln Sie Daten, wie Fluoreszenzmessungen aus den Bildern (Graustufen, die Intensitätsstufen) und Export unter Text-Format und zu behandeln, wie unten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm erläutert. </li><li> Berechnen intrazellulären pH-Wert für jede einzelne Zelle oder eine Region von Interesse unter Verwendung der folgenden Gleichung: pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Durch Drücken der F min (λ2) / F ma x (λ2) -Verhältnis, wenn es Sonde Bleichen oder Leckage, was zu einer Abnahme der 450 nm-Fluoreszenz während der gesamten Experimente. Dies ist aber nur sehr selten in den in der des verwendeten Bedingungen beobachtetcribed Experimente. </li><li> Da die Kalibrierungsdaten am Ende jedes der pH-Messung vorhanden sind, zu überprüfen, ob die entsprechenden berechneten Werte die pH-Werte für die Kalibrierung verwendet werden, unterscheiden. Wenn dies der Fall ist, stellen Sie dann alle experimentell bestimmten pH-Werte für die Kalibrierung mit dem folgenden Verfahren: <ol><li> Berechnen des folgenden Quotienten (Q, die Differenz zwischen der gemessenen Werte / Unterschied zwischen der Kalibrierungswerte). Multiplizieren Sie die gesamte Datenmenge von Q. Nehmen Sie die endgültige Einstellung durch Addition oder Subtraktion, so dass die berechneten Werte werden die entsprechenden Kalibrierungswerten entsprechen. </li></ol></li></ol> 3. Messungen der Anfangsgeschwindigkeiten von NHE7 von Fast Li + Uptake <ol><li> Saatgutzellen auf Multi-Well-Platten (6 bis 24 Vertiefungen) und säuert sie entweder mit der oben oder abwechselnd die Nigericin / Rinderserumalbumin (BSA) in 20 beschrieben Ansäuerung beschrieben NH 4 + Beladungstechnik. </li><li&gt; Rinse Platten zweimal schnell unter Verwendung der oben beschriebenen Spüllösung und dann Inkubieren der Zellen in die Aufnahme Lösungen enthaltend 1-10 mM Lithium (leicht unterhalb Km-Werte) und die gewünschten Konzentrationen der Kationen und / oder Inhibitoren von Interesse für die gewünschte Menge der Zeit. </li><li> Halten Sie kurz und konsistente Aufnahme Dauer (in der Regel 1 Minute oder weniger), um sicherzustellen, dass der Transport ist im Anfangsgeschwindigkeiten Bedingungen. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle für die Aufnahme verwendeten Lösungen sind isotonisch. </li><li> Am Ende der Aufnahmezeit, sorgfältig beseitigt die Aufnahmemedium und die Zellen werden viermal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie diese wäscht so schnell wie möglich (weniger als 10 Sekunden für die vier von ihnen ist ideal), um Lithium-Efflux verhindern. </li><li> Lyse der Zellen in 25% ige Salpetersäure. Apply 250 ul pro Vertiefung von 25% Salpetersäure und lassen Sie es für mindestens 1 h sitzen, dann Schrott jede Vertiefung mit dem Ende der Pipettenspitze und überweisen Sie den ganzen gut Suspension in einem neuen microcentrifuge Rohr. </li><li> Übertragen des Lysats in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren 5 Minuten lang bei 15.000 × g (Raumtemperatur), um die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Messung der Lithiumgehalt der Überstände durch Atomabsorptionsspektroskopie 21. HINWEIS: Verschiedene Unternehmen bieten Atomabsorptionsspektrometer, das mit einer Lithium-Hohlkathodenlampe ausgestattet werden müssen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wie diese Maschinen sind sehr präzise, ​​sondern auch sehr empfindlich. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen, die intrazelluläre Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran, ohne dass ihre Primärsequenz durch ortsgerichtete Mutagenese ausgewählt. Diese Austauscher kann nun charakterisiert werden. Dieses Verfahren basiert auf der zellulären Toxizität von intrazellulärem Protonen basierend auf Zelllinien, die vesikulären Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran exprimieren wählt. Es könnte möglich sein, i...

Die meisten intrazellulären Kompartimenten Anzeige eine saure luminalen pH-Wert, der einer der wichtigsten Parameter für die Reifung, Menschenhandel, Recycling von Proteinen oder Hormonen und Neurotransmittern Laden ist. Es wurde gezeigt, dass der pH-Gradient zwischen Cytosol und vesikulärer Gehalt durch vakuoläre H + ATPasen 1 erzeugt, um vesikuläre ClC Chloridtransporter 2 gekoppelt. Sowohl in Knock-out (KO) Mäusen und menschlichen Patienten ist die Bedeutung dieser Transporter durch die schweren Phänotypen, die durch Mutationen in ihren Genen 3-6 verursacht hervorgehoben. Die Mitglieder des Sodium-Hydrogen Tauscher SLC9A Familie, genannt auch NHEs für Na + / H + Austauscher haben, dass sie Schlüssel Effektoren der intrazellulären pH-Wert und Zellvolumenregulation sowie in vektorieller Transport von Säure-Basenäquivalente durch das Zellgewebe sein . Neben der Plasmamembran NHEs drei hochkonservierten Na + / H + Austauscher NHE 6, 7und 9 sind in trans-Golgi Netzwerk und Anfang Endosomen 7 ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit Angelman-like oder Christi Syndrome 8-9, familienbasierten Autismus 10 und Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung 11-12 verbunden. Diese Tauscher auch bei neurodegenerativen Probleme wie Alzheimer Krankheitsanfälligkeit 13 und X-chromosomale geistige Retardierung zusammenhängenden Gene Syndrome 14 beteiligt. Zusammen genommen verdeutlichen auch diese Studien die Bedeutung dieser intrazellulären NHEs der Gehirnentwicklung und / oder Funktion. Die intrazelluläre Lokalisation dieser Tauscher verhindert genaue Messungen der Ionenselektivität, Transportrichtung, kinetische Parameter und Regulierung. Wie ist der Fall für alle Transporter in intrazellulären Kompartimenten ausgedrückt, äußerst schwierig, ihre biochemischen Aktivitäten zu bewerten und damit zu ihrer physiologischen Funktionen und die mechan vollständig zu verstehen istIsmen zugrunde liegenden pathologischen ihre Auswirkungen. Aufgrund der hohen cytosolische K + -Konzentration, war die allgemein akzeptierte Hypothese, dass sie als K + gekoppelten Protonen Efflux-Transporter arbeiten. Die Existenz einer solchen Protonenleck hatte Hypothese aufgestellt, wie es Protonenpumpen durch den V-ATPasen, um einen stationären Zustand vesikulären pH aufrechtzuerhalten leichen. Das Ziel dieser visuellen Gegenstand (i), ein Verfahren, das die genetische Selektion von Zelllinien, die solche vesikuläre Transporter an ihrer Plasmamembran zu exprimieren, und (ii) an zwei unabhängige Ansätze, um die Funktionen dieser Transporter messen zeigen ermöglicht demonstrieren. Vor drei Jahrzehnten Pouysségur und Franchi eine genetische Ansatz, der die molekulare Klonierung und Charakterisierung der Mitglieder der NHE Familie 15 aktiviert voran. Dies wurde auf die Toxizität von intrazellulärem Protonen als Screening Methode. Der erste Schritt war, um Zelllinien zu erhalten defizientenjeden Na + / H + -Austausch ausgedrückt in der Plasmamembran mit Hilfe der Reversibilität dieses Transporters. Fibroblasten (CCL39-Zellinie) wurden mit Na + oder Li + vorgespannt und dann in einer sauren extrazellulären Mediums (pH 6,5) für 2 Stunden platziert. Dies führte zu dem Tod von Zellen, die einen funktionellen Na + / H + -Austausch zu aktivieren und auf die Auswahl von Antiporter-defizienten Zellen (PS120 Zellinie) 16. Wenn Bicarbonat-freiem Medium kultiviert werden, diese Zellen sind sehr empfindlich gegenüber akuten intrazellulären Ansäuerung. Infolgedessen wird die Expression eines beliebigen Funktionsprotonen Effluxmechanismen an der Plasmamembran positiv gewählt werden (siehe 17), wenn diese Zellen in akuten intrazellulären Ansäuerungen eingereicht. Solche Versauerung Techniken können verwendet werden, um Zelllinien mit Handel Defekte ermöglicht die erzwungene Expression von WT intrazellulären NHEs an der Plasmamembran zu isolieren. Als eukaryontische Na + / H+ Tauscher sind elektro, sie sind nicht messbar durch die elektrophysiologische Ansätze, die mit großem Erfolg eingesetzt worden sind, um Kanäle zu messen. Dieses Manuskript daher demonstriert, wie die Aktivität dieses Tauscher durch intrazelluläre pH-Messungen und schnelle Kinetik der Lithiumaufnahme messen. Da die zugrunde liegenden Konzepte die gleichen sind, ist es interessant zu bemerken, daß viele der für den Auswahlabschnitt entwickelten Verfahren auch direkt für die funktionelle Messungen verwendet. Interessanterweise haben wir festgestellt, dass der Menschenhandel Defekt in der Zelllinien mit Hilfe der in dieser Handschrift beschriebenen Ansatz gewählt vorhanden führt zu einer größeren Expression von anderen vesikulären Proteine ​​an der Plasmamembran wie der vesikulären Kaliumkanal TWIK1 18. Dies weist darauf hin, in Richtung auf die Auswahl einer allgemeinen Retentionsdefektmechanismus vesicularis Transmembranproteine. Daher ist diese Auswahlverfahren und die Zellen, die es generiert Maistellen ein vielversprechendes Werkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft der Arbeit an den Membranproteinen von intrazellulären Kompartimenten. Sowie die Messtechnik hier vorgestellten könnten anwendbar für die Untersuchung anderer nicht-elektroTransporter sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard cell culture equipement</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator with CO2</td>
			<td style="width:119px;">Sanyo</td>
			<td style="width:119px;">MCO15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Incubator without CO2</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus instrument</td>
			<td style="width:119px;">BB6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laminar flow hood PSM1200NF</td>
			<td style="width:119px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">52010120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS gold</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:119px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 10X</td>
			<td style="width:119px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICE 3500 GFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCl</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitric Acid</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluorescence videomicroscopy set</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Composed of many devices with different catalog numbers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted automated microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope stand</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11505180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">incident fluorescence</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11504166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">motor bracket</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11505234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11522106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED transmission light&#160;</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8097321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">8102034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">motorized plate</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11522068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11531172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">camera output</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11507807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11541510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">images acquisition/analysis software</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optics</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence Xenon lamp</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td style="width:119px;">DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">camera</td>
			<td style="width:119px;">hamamatsu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8100601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metafluor/Mmfluor software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11640905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pH sensitive probe, BCECF-AM</td>
			<td style="width:119px;">life technologies</td>
			<td style="width:119px;">B1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigericin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

Endosomalen Ansäuerung ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Prozessen, wie zB Protein-Recycling und Abbau, Rezeptordesensibilisierung und Neurotransmitter Belastung in synaptischen Vesikeln. Diese Ansäuerung wird beschrieben, dass durch Protonen-ATPasen, um ClC Chloridtransporter gekoppelt vermittelt werden. Hochkonservierten elektro Protonen Transporter sind die Na + / H + Austauscher (NHE) 6, 7 und 9 auch in diesen Kammern ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit der menschlichen kognitiven und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Paradoxerweise bleibt ihre Rolle schwer fassbar, da ihre intrazelluläre Lokalisation hat detaillierte funktionelle Charakterisierung verhindert. Diese Handschrift zeigt ein Verfahren, um dieses Problem zu lösen. Diese besteht aus der Auswahl der mutierten Zelllinien, fähig zu überleben akuten cytosolische Ansäuerung durch Halte intrazellulärem NHEs an der Plasmamembran. Es zeigt dann zwei sich ergänzenden Protokolle, um die Ionenselektivität und Aktivität zu messendieser Austauscher: (i) eine auf die intrazelluläre pH-Messungen unter Verwendung von Fluoreszenzvideomikroskopie, und (ii) eine auf der Basis der schnellen Kinetik der Lithiumaufnahme. Solche Protokolle können extrapoliert werden, um andere nicht-elektro Transporter zu messen. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Auswahlverfahren erzeugt Zellen mit einem intrazellulären Retention defekt Phänotyp. Daher werden diese Zellen exprimieren auch andere Vesikelmembran Proteine ​​an der Plasmamembran. Die hier dargestellte experimentelle Strategie kann daher eine potentiell leistungsfähiges Werkzeug, um andere intrazelluläre Proteine, die dann an der Plasmamembran zusammen mit der vesikulären Na + / H + Austauscher für die Auswahl verwendet ausdrücken zu studieren.

Auswahl: Die H + tötet Auswahl basiert auf der Diffusion des Ammonium schwachen Base basiert, wie in 1A dargestellt. Die Wirkung von schwachen Basen und Säuren Diffusion auf intrazelluläre pH wurde von Walter Boron und Mitarbeiter 22 Pionierarbeit geleistet. Das elegante Idee, dieses Phänomen zu nutzen, um zu produzieren eine tödliche Versauerung für positive genetische Selektion wurde dann von Jacques Pouysségur 17 entwickelt. Unter s...

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Aufrufe.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Serie: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...