Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.

HINWEIS: Die verwendeten Protokolle sind von unseren institutionellen Tierforschung Ethikrat an der McMaster University nach Canadian Council on Animal Care-Richtlinien zugelassen. Die Experimente wurden an der McMaster Universität Zentrale Tierlabor durchgeführt. 1. Die Kultivierung LCRT Cells <ol><li> Kultur LCRT Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Pflegen Zellen in T-150 Gewebekulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2. Passage-Zellen, wenn sie sich bilden, eine 90% konfluente Monoschicht (alle 2-3 Tage, Abbildung 1). </li><li> Vorwärmen 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1x Trypsin und Medium in ein 37 ° C Wasserbad für 10 min vor dem Splitten der Zellen. </li><li> Aspirat Medium aus dem Kolben und spülen Zellen mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Nach dem Abspülen absaugen PBS und InkubationZellen mit 2 ml 1X Trypsin bis Zellen dissoziiert aus dem Kolben (~ 2 min). </li><li> Zellen in 8 ml Medium (für insgesamt 10 ml Zellsuspension) und sanft Pipette auf und ab zu brechen Zellklumpen. </li><li> Pflegen Zellen in einem T-150-Kolben durch Impfen 1 ml Zellsuspension in 24 ml Medium (mit insgesamt 25 ml pro T-150) und Rock Kolben sanft von einer Seite zur anderen. Pflegen Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum nächsten Split. </li></ol> 2. Beurteilung der Virusreplikation und Zytotoxizität in LCRT Cells <ol><li> Virus-Replikation HINWEIS: Virus-Konstrukte ein Fluoreszenz-Tag zum Ausdruck, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), unter der Kontrolle der endogenen viralen Promotoren zu erleichtern Visualisierung von Virus-Infektion und verbreitet mit Fluoreszenz-Plattenleser. <ol><li> Seed LCRT Zellen in Kulturschalen, so dass ein gut für die Zählung. Samenzellen, dass sie 80-90% konfluent einen Tag mehr sein. Verwenden Sie eine Konzentration von 10 5 cells / ml (100 ul pro Vertiefung), um die gewünschte Konfluenz einen Tag später in 96-Well-Flachbodenplatten zu produzieren. </li><li> Am nächsten Tag, vorwärmen 1x PBS, 1x Trypsin, vollständig und serumfreien Medium in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten vor dem Start des Experiments. </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Zählen gut und spülen Zellen mit 5 ml 1x PBS durch Schwenken über die Oberfläche des Brunnens. </li><li> Nach dem Abspülen absaugen PBS und Inkubation Zellen mit 2 ml 1x Trypsin, bis die Zellen distanzieren sich ausdrücklich von den Kolben (~ 2 min). </li><li> Die Zellen in dem entsprechenden Volumen von komplettem Medium auf eine Zelldichte innerhalb des Bereichs zählbaren Ausbeute unter Verwendung eines Hämocytometers. Um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten, gründliche Durchmischung der Zellsuspension vor dem Impfen der Zählkammer durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Bestimmen das Volumen der Virusbestand für die Infektion in der gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) erforderlich. Erforderliche Paque bildenden Einheiten (pfu) = Anzahl der plattierten Zellen * MOI(Pfu / Zelle) Volumen der Virusstamm erforderlich = Pflicht pfu / Virus-Stamm Titer (pfu / ml) </li><li> Bereiten Virusinokulum in serumfreiem Medium in Röhrchen. Gründlich mischen durch Vortexen oder Pipettieren bevor Inokulum zu den Zellen. </li><li> Infizieren Zellen für 1 h bei 37 ° C, wonach Anwendung eines Wartungs Overlay DMEM + 1% FBS. </li><li> Scan-Platten ein und zwei Tage nach der Infektion (pi) auf GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen. </li></ol></li><li> Virus Zytotoxizität HINWEIS: Führen Sie die Resazurin Zytotoxizitätsassay bei schlechten Lichtverhältnissen, wie die Verbindung lichtempfindlich ist. Nur ein gut enthaltenden Medium sollte einbezogen werden, um für die Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren. <ol><li> Eine 5% ige (v / v) Lösung von Resazurin in 1x PBS. Mischen Sie die Lösung mit einer Pipette. </li><li> Absaugen Medium von Zellen, und ziehen Sie die 5% Resazurin-Lösung. Fügen Sie ein gut haltigen Medium nur für Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 30 min bei 37 ° C, nach demdie lesen Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Anregung 530 nm, Emission 595 nm). </li><li> Analysieren Daten relativ zu infizierten Kontrollen Korrektur Hintergrundfluoreszenz. </li></ol></li></ol> 3. Gehäuse und Handhabung <ol><li> Gehäuse und Diät <ol><li> Haus Baumwollratten einzeln in Bekämpfung in Polycarbonat Ratten Käfige Nager Betten (1/8 &quot;Maiskolben Betten), einen Teil der PVC-Schlauch nicht mehr als 8 Zoll und nestlets als Bereicherung (Abbildung 2), die zu verringern. </li><li> Verwenden Sie einen sicherungsfähigen Stahlkorb zu überragen des Käfigs zu sitzen und enthalten Nagerfutter und eine Flasche Wasser. HINWEIS: Dieser Käfig Setup für einfache und sichere Erfassung der Tiere zu ermöglichen, mit der Platzierung der Anreicherung Rohr gegen das Ende des Käfigs Befinden von größter Bedeutung. </li></ol></li><li> Handhabung <ol><li> Griff Baumwollratten am Morgen, vor dem Runden von Tieranlage Techniker vor vermeiden spannende ihneneine Prozedur. </li><li> Bei allen Verfahren, tragen dicke Lederhandschuhe für den Schutz. </li><li> Da die Tiere vor allem in den Anreicherungsrohre bleiben, nutzen sie, um die Ratten während der routinemäßigen Reinigung in einen neuen Käfig übertragen. Alternativ öffnen Sie den Käfig leicht, damit der Handler, um ihre Hand in zu erreichen, kann das Tier dann durch scruffing die Haut direkt über den Schultern und schob sich zurückgehalten werden. Sorgfältig keine übermäßige Kraft verwenden, wie das Tier die Zunge beißen. </li><li> Seien Sie geduldig und verwenden Sie eine ruhige Hand, wie die Tiere haben eine starke Flug-oder-Kampf-Reaktion und werden versuchen, Gefangennahme durch Laufen und Springen aus dem Käfig zu vermeiden. Wichtig ist, dass keine Tiere behandeln Sie am Schwanz als degloving auftreten. </li><li> Fangen die Tiere in ihrer Anreicherungen Rohre über direktes Handling. Diese drastisch ab Verletzungen und Flucht. </li></ol></li></ol> 4. Erfassung und Anästhesie <ol><li> Erfassung <ol><li> Tragen Sie dicke Lederhandschuhe für schützenIon in allen Verfahren. </li><li> Verwenden Sie eine große durchsichtigen Kunststoff-Container mit Löchern für Luft und einem Deckel, einer Narkoseeinleitung Kammer groß genug sein, um den Behälter und einen Nasenkegel auf die Gasausgangsschlauch (Bild 3) ausgestattet passen. </li><li> Paarweise zusammenarbeiten, damit das Verfahren effizienter und um die Belichtungszeit der Tiere bis zu Isofluran Inhalationsanästhetikum verringern. Achten Sie darauf, ein Forscher ist zum Öffnen und Ersetzen der Stahlabdeckung auf dem Käfig und dem Deckel der Induktionskammer (Handler # 1) verantwortlich und ihre Mitarbeiter ist für die Aufnahme des Tieres in der Röhre und den Transport in die Induktionskammer zuständig (Handler # 2). </li><li> Setzen Sie den Käfig auf eine ebene Fläche und entfernen Sie den äußeren Deckel. Heben Sie die Stahleinzugsfach leicht und langsam manövrieren die Anreicherung Rohr so ​​parallel zu den Seiten des Käfigs und gegen die Rückseite ist. Verwenden Sie bei Bedarf ein Objekt, um die Anreicherung Rohr ohne Öffnen des Käfigs zu vermeiden Rühren der Tier manövrieren (GriffR # 1). </li><li> Wenn das Tier aufgeregt und verlässt das Rohr, lassen Sie genügend Zeit für das Tier zu entspannen und wieder in das Rohr (Handler # 1) zu begleichen. </li><li> Langsam und gezielt heben die Kante des Stahlabdeckung weitesten vom Anreicherungsrohr, wobei das andere Ende in Kontakt mit dem Käfig. Machen Sie einen Raum groß genug für die Kunststoffbehälter (Handler # 2). </li><li> In einer glatten, schnellen Bewegung, drücken Sie den Kunststoffbehälter überragen der Anreicherungsrohr. Halten den Kontakt des Behälters mit der Seite des Käfigs, Einfangen des Tieres in der Röhre. Führen Sie die Schritte 4.1.6 und 4.1.7 so schnell wie möglich (Handler # 2). </li><li> Entfernen Sie die Stahleinzugsfach und geben dem Kunststoffbehälterdeckel zu Handler # 2 (Handler # 1). Schieben Sie den Kunststoffdeckel von der Seite des Käfigs und dem Behälter, wenn ich denke an Anhängsel der gefangenen Tieres in den Prozess. Den Behälter nicht verschließen, da dies der nächste Schritt zu erschweren (Handler # 2). </li></ol></li><li> Anesthesia <ol><li> Sicherstellen, dass der Behälter bleibt geschlossen und zum Transport des Tieres in die Induktionskammer. Legen Sie schnell das Tier in der Kammer und entfernen Sie den Behälterdeckel in einer flüssigen Bewegung (Handler # 2). Öffnen und die Induktion Kammerdeckel sofort zu ersetzen (Handler # 1). </li><li> Schalten auf den Fluss von Isofluran mit der Induktionskammer (5 l / min) und zu überwachen, das Tier Anzeichen von Lethargie, an welchem ​​Punkt schnell gleiten das Tier aus dem Rohr und dem Behälter, Entfernen sowohl von der Induktionskammer zur Gaszirkulation ermöglichen. </li><li> Wenn die Ratten vollständig betäubt wird, bewegen sie auf die Arbeitsfläche und legen Sie die Nase und den Mund in den Nasenkegel (Abbildung 3). Die Ratte ist vollständig betäubt, wenn sie nicht mehr auf einem kräftigen Zehen Prise ist. </li><li> Zeigen Tierarzt Vaseline Augensalbe auf die Augen des Tieres bis zur Trockenheit und Schürfwunden zu verhindern. Dies ist ein wesentlicher Schritt, wie Baumwollratten haben große Augen, die für Infektionen anfällig sein kann, wenn Verletzung auftritt. </li> &lt;li&gt; sorgfältig zu überwachen und eine konstante Atemfrequenz und damit der Nase des Tieres in der Nasenkegel während des gesamten Verfahrens Montage bleibt. Die Durchflussmenge von Isofluran angemessen. Die Höhe der Isofluran erforderlich, um zu betäuben jedes Tier variieren. </li><li> Post-Verfahren, bringen Sie das Tier in seinen Käfig und sicherzustellen, dass er die volle Mobilität und Brustlage gewinnt. </li></ol></li></ol> 5. Herstellung von LCRT Cells zur subkutanen Tumorentstehung ANMERKUNG: Eine T-150-Kolben LCRT (90% Konfluenz) ergibt ca. 2 x 10 7 Zellen. Basieren Sie die Anzahl der T-150-Kolben auf der Gesamtzahl der Zellen erforderlich erforderlich. Saatgut zusätzliche Kolben um die Gesamtzahl von Zellen erforderlich ist, erhalten zu gewährleisten und Zellen während der Herstellung und die für zusätzliche Injektionen benötigt verloren aufzunehmen. Halten Sie Zellen auf Eis, wenn möglich die Lebensfähigkeit der Zellen zu verlängern. <ol><li> Um Zellen, absaugen Medium aus dem Kolben eine Ernted rinse-Zellen mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Absaugen PBS und Inkubation Zellen mit 2 ml 1x Trypsin, bis die Zellen distanzieren sich ausdrücklich von den Kolben (~ 2 min). </li><li> Zellen in 8 ml Medium (für insgesamt 10 ml Zellsuspension) und sanft Pipette auf und ab zu brechen Zellklumpen. Weiter zu Zellen von zusätzlichen Kolben ernten. </li><li> Pool alle Zellsuspensionen in einem konischen Rohr, etwa 4 T-150s pro 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge das Rohr bei 160 x g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Absaugen Medium und Zellpellet in dem entsprechenden Volumen PBS (10 ml PBS pro T-150), um eine Zelldichte in der abzählbaren Bereich ergeben mit einer Zählkammer. Um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten, gründliche Durchmischung der Zellsuspension vor dem Laden der Zählkammer durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Berechnen der Gesamtzahl der Zellen: Gesamtzahl der Zellen geerntet = Zellzahl (Zellen / ml) x Resuspensionsvolumen (ml) </li><li> Bestimmendas Volumen der Zellsuspension für alle Injektionen erforderlich. Stellen 2-3 die Dosis pro Experiment. Insgesamt wurden 5 × 10 5 LCRT Zellen subkutan injiziert wird tastbaren Tumoren innerhalb von 3-4 Tagen zu bilden. Gesamtzahl der Zellen benötigt = 5 x 10 5 Zellen x Gesamtzahl der Dosen Volumen Zellsuspension benötigt (ml) = (erforderlich * Summe der Einspritzvolumina Gesamtzellen) / (Gesamtzahl der Zellen geerntet) </li><li> Pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in eine konische Röhrchen mit PBS und gründlich mischen. Aliquoten Einzeleinspritzungen (100 ul) in Eppendorf-Röhrchen. Während der Einspritzvorgang Röhrchen auf Eis halten. </li></ol> 6. Injektionen HINWEIS: Führen Sie die Verfahren mit zwei Forscher, ein, um die Injektionen, während die anderen Monitore Atmungsrate der Tiere und den allgemeinen Zustand, während unter Narkose durchzuführen. Verwenden Insulinspritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) für alle Injektionen und eine neue Nadel fürjedes Tier. <ol><li> Subkutane Injektionen <ol><li> Zu erfassen und zu betäuben das Tier (Abschnitt 4). </li><li> Rasieren Sie die Injektionsstelle mit Klipper. Baumwollratten Fell ist dick und erfordert eine scharfe Schneid um eine glatte Oberfläche für Injektionszwecke zu erhalten. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen. </li><li> Last Spritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) mit den Zellen durch die Erstellung von langsam und stetig. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit ist an der Spitze der Nadel. </li><li> Heben Sie die Haut an der Injektionsstelle (wie Haut Zelten bezeichnet), und führen Sie die Nadel Kegel Seite nach oben. Achten Sie darauf, die Nadel bewegt sich frei unter der Haut zu vermeiden, die Injektion intramuskulär. </li><li> Vertreibung der Inhalt der Spritze langsam und gleichmäßig. Ziehen Sie die Nadel Kegelseite nach unten. </li></ol></li><li> Intratumorale Injektionen <ol><li> Erfassen Sie eind betäuben das Tier (Abschnitt 4). </li><li> Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen. </li><li> Last Spritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) mit dem Virus Inoculum durch die Erstellung von langsam und stetig, während die Nadel in einer aufrechten Position halten. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze Push dann Kolben, bis die Flüssigkeit an der Spitze der Nadel. </li><li> Führen Sie die Nadel Kegelseite nach oben in den Tumor und die Inhalte der Spritze auszustoßen langsam und gleichmäßig während der Bewegung der Nadel in einem fächerförmigen Muster, teilweise Zurückziehen der Nadel vor jeder Bewegung Platzwunde des Tumors zu verhindern. Ziehen Sie die Nadel Kegelseite nach unten. HINWEIS: Die subkutane LCRT Tumoren schnell wachsenden und erreichte etwa 100 mm 3 in 5-7 Tagen sind. Weiterhin bilden nekrotischen und hämorrhagische Zentren oft auf der Oberfläche des Tumors innerhalb von mehreren Tagen und erfordern caReful Überwachung (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Intraperitoneale Injektionen <ol><li> Zu erfassen und zu betäuben das Tier (Abschnitt 4). </li><li> Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen. </li><li> Last Spritzen (29 G x 1/2 &quot;, 0,3 ml) mit dem Medikament durch die Erstellung von langsam und stetig. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze Push dann Kolben, bis die Flüssigkeit an der Spitze der Nadel. </li><li> Führen Sie die Nadel in den rechten unteren Quadranten des Bauches. Ziehen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass Blut oder Kot wird nicht angesaugt ist, zeigt dies eine falsche Platzierung der Nadel. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie die Nadel und bereiten eine neue Spritze. Wenn die Nadel richtig eingesetzt, Inhalt der Spritze auszustoßen gleichmäßig und langsam. </li></ol></li></ol> 7. Tumorentfernung und Necropsy <ol><li> Sammeln und Reinigen all Werkzeuge mit 70% igem Ethanol vor der Euthanasie der Tiere. </li><li> Euthanize das Tier durch das gewünschte Verfahren wird CO 2 Inhalation (2 l / min 5-10 min) empfohlen. Untersuchen Sie das Tier für alle Anomalien in Körperkondition. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Dissektion Bord und reinigen Sie das Tier mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Haut am Unterbauch zu heben. Schnitt durch die Haut und Muskeln mit einer Schere und eine mediale Inzision entlang der Länge des Tieres (Anus bis zum Kinn). </li><li> Schneiden Sie den Brustkorb, indem zwei Schnitte, eine seitlich an der Seite des Brustkorbs und eine über dem Brustbein, um das Herz und die Lunge aus. Untersuchen Sie die Lungenlappen für Metastasen 27,29. </li><li> Überprüfen Sie alle Organe auf Anomalien untersuchen und etwaige Änderungen in Farbe, Größe und Konsistenz. Falls erforderlich, einschneiden die Organe mit einem Skalpell zu inneren Geweben zu untersuchen. Insbesondere prüft die Leber, Nieren, Milz und Magen-Darm-Traktes. </li><li> Überprüfen Sie die Lymphknoten Metastasen und Erweiterung 27,29. </li><li> Um den Tumor zu sammeln, müssen Flanke Einschnitte oberhalb und unterhalb des Tumors, so dass sich die Haut vom Körper mit einer Pinzette herausgezogen werden. Während Festhalten der Haut mit einer Pinzette, mit einem Skalpell vorsichtig den Tumor, indem zwischen dem Tumor und Dermis (Abbildung 5). </li><li> Sofort setzen Sie den Tumor in einem beschrifteten Behälter von 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Abhängig von der Größe des Tumors, 1-2 Tage (≤ 2 mm, klein) oder 5-6 Tage (&gt; 2 mm, groß) zur Befestigung vor Vorbereitungsabschnitte für die histologische Analyse (Abbildung 6). </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ICP0-Null+HSV-1+and+interferon+signaling+defects+in+the+effective+treatment+of+breast+adenocarcinoma.">The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma.</a> Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).</li><li>Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunization+with+recombinant+adenoviruses:+induction+of+immunity+and+protection+of+cotton+rats+against+respiratory+bovine+herpesvirus+type+1+infection.">Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection.</a> J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).</li><li>Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pre-existing+adenovirus-specific+immunity+on+immune+responses+induced+by+recombinant+adenovirus+expressing+glycoprotein+D+of+bovine+herpesvirus+type+1.">The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1.</a> Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).</li><li>Mittal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+cotton+rats+immunized+with+human+adenovirus+type+5+recombinants+expressing+the+full+and+truncated+forms+of+bovine+herpesvirus+type+1+glycoprotein+gD.">Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD.</a> Virology. 222 (2), 299-309 (1996).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+Cotton+Rat+Cancer+Model+for+Replicating+Adenoviral+Vectors.">Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors.</a> Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).</li><li>Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).</li><li>Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent,+semi-permissive+cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent+syngeneic+cotton+rat+tumor+models+for+the+assessment+of+replication-competent+oncolytic+adenovirus.">Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus.</a> Virology. 369 (1), 131-142 (2007).</li><li>Workenhe, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+HSV-mediated+oncolysis+shapes+the+antitumor+immune+response+and+contributes+to+therapeutic+efficacy.">Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy.</a> Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).</li><li>Sobol, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+antiviral+immunity+is+a+determinant+of+the+therapeutic+success+of+oncolytic+virotherapy.">Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy.</a> Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).</li><li>Prince, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cotton+Rat+in+Biomedical+Research.">The Cotton Rat in Biomedical Research.</a> Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).</li></ol>

The authors acknowledge there are no financial conflicts of interest related to this research.

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani...

Onkolytischer Viren (OV) selektiv in Tumorzellen zu replizieren, indem biochemische Unterschiede zwischen normalen und Tumorzellen 1,2. Es gibt zwei Arten von OVs: solche, die keine Mutation an selektiven Onkolyse zu erreichen, die als natürlich vorkommende Wildtyp-Viren und solche, die dazu entworfen sind, um eine selektive Onkolyse erzielen. Die Sammlung von Mutationen in einem bestimmten Tumortyp bestimmt die Art der selektiven Wachstumsvorteil gegenüber normalen Zellen für eine OV 2. Die Sicherheit und der Vorteil der Verwendung OVs wurde in klinischen Studien 3-7 gezeigt. Trotz Fortschritten auf dem Gebiet der onkolytischen Virotherapie existieren Lücken zwischen präklinischen und klinischen Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass eine bessere Modelle werden benötigt, um die Antitumor-Wirksamkeit von OVs bewerten. Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist ein Mitglied der Familie Herpesviridae und Alphaherpesviridae Subfamilie. BHV-1 initiates Atemwegserkrankungen beim Rind Komplex bei Rindern, manifestiert sich in einer Vielzahl von Symptomen ähnlich einer Erkältung 8,9. BHV-1 bindet durch HSV-1 verwendet Befestigung und Eintrittsrezeptoren, wie Heparansulfat und Nectin-1 10. Jedoch bindet CD155 an die Stelle der Nectin-2 10. BHV-1 hat einen sehr engen Wirtsbereich, so dass er nicht in der Lage, effizient ein und initiiert die Replikation in normalen und transformierten Mäusezellen 3,4,10 ist. Dies macht den Einsatz von herkömmlichen murinen Modellen problematisch. Onkolytisches Kapazität von BHV-1 wurde in vitro 11,12 nachgewiesen. BHV-1 wurde gezeigt, dass die Replikation in einer Vielzahl von histologischen Ursprungs, einschließlich Brustkrebszellen und Brustkrebszellen initiieren 11,12 initiieren und zu töten menschlichen Tumorzellen. Jedoch muss die Antitumor Kapazität von BHV-1 in vivo im Kontext eines immunkompetenten Wirts ausgewertet werden. Menschliche Adenovirus (Ad), für welcheEs gibt 57 identifizierte Serotypen, am häufigsten verursacht Atemwegserkrankungen beim Menschen. Onkolytischen Ad-Vektoren wurden für ihre Antitumorwirksamkeit mit mehreren fort in klinischen Studien 13 bis 15 bewertet worden. Trotz vielversprechender präklinischer Daten haben klinische Ergebnisse hinter den Erwartungen zurück. Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen werden typischerweise verwendet, um die Antitumor-Wirksamkeit von Ad Vektoren zu untersuchen, obwohl zeigen sie abgeschwächt Immunreaktionen auf den Virus 16,17. Darüber hinaus sind syngenen Mausmodell nicht-permissiven zur Ad-Infektion, so dass die Auswertung der Wirtsimmunreaktionen mit diesen Modellen unpraktisch 17,18. Der Host-Immunsystem als der einflussreichste Mechanismus, durch den OVs entlocken Tumorzelltod 19 identifiziert. Antitumor-Antworten zwischen tolerierten und nicht-tolerierten Tumor-assoziiertes Antigen (TAA) Modelle unterscheiden und kann stark Einfluss auf den Erfolg der OV-Therapie. Das HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 1814 20) 20,21 ausgelöst Tumorrückgang bei 80% der tumortragenden Mäusen in einem murinen Polyoma Mittel T-Antigen Brustkrebsmodell 22. Doch in HER-2 / neu-Modelle, die Antitumor-Wirksamkeit von KM100 variiert zwischen 20% vollständige Regression in syngenen Mäusen und Tumor Stase in transgenen, HER2-toleranten Mäusen. Zusammen stellen diese Daten unterstreichen die Bedeutung einer vollständigen Auswertung OVs anhand von Tiermodellen, die am besten zu rekapitulieren das menschliche Immunsystem Landschaft zu verstehen, welche Funktionen bestimmen den Therapieerfolg. Die Baumwollratte (Sigmodon hispidus), heimisch in Nord- und Südamerika, wird am häufigsten als ein Modell der RS-Virus-Infektion (wie in 5 überprüft). Baumwollratten sind auch in anti-BHV-1-Impfung Forschung verwendet, da sie die Pathologie, die mit Atemwegserkrankungen beim Rind komplexen 6,23 verbunden rekapitulieren. Weiterhin BHV-1-Infektion von Baumwollrattenimmunogen und induziert anhalt Schleimhaut und systemische Immunreaktionen 6,23-25. Zelllinien wurden aus spontanen Fibrosarkom und Osteosarkom der Brustdrüse (LCRT) und Knochen (CCRT und VCRT) bzw. 26 abgeleitet. Baumwollratten wurden verwendet, um die in vivo Wirksamkeit von onkolytischen Ad Vektoren zu bewerten, da sie anfällig für Ad-Infektion sind und eine ähnliche Pathologie an Menschen 27-29. Die Verwendung von immun Modelle für die präklinische Bewertung OVS sind nicht nur weniger anzeigt klinische Ansprechen auf die Therapie, aber sie berücksichtigen nicht die Rolle des Immunsystems bei onkolytischen Virotherapie 30,31 statt. Daher ist die syngene Tumor tolerisiert Baumwollrattenmodell des Mammakarzinoms und Osteosarkom relevant sind Modelle, in denen die präklinische Wirksamkeit OVs wie BHV-1 und Ad die unter Verwendung herkömmlicher Mausmodellen nicht untersucht werden können, zu bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>May use any brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can prepare in lab, filter to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030164</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>110-001-101HI</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-80</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, flat bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td>May use any brand, must be tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>May use an alternative reagent for determination of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8640 Teklad 22/5 Rodent diet</td>
			<td>Harlan&#160;</td>
			<td>8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; corncob rodent bedding</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>7092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestlets</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>-</td>
			<td>Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>May use any brand, must be sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can prepare in lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>Model used not currently available</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio BioAnalyzer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Anaesthesia machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any brand, must be portable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Peanut Mini Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>May use any brand of small clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes 29 G x 1/2&#39;, 0.3 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat&#8217;s tough skin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>MedPro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8940</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-41</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Durch die extrem erregbarer Natur der Baumwollratten, da kennen und Verwendung von Verfahren optimiert, um die Belastung der Tiere zu reduzieren wird bei der Nutzung als präklinischen Tiermodell zu erleichtern. Verwendung der richtigen Handhabungstechniken minimiert auch die Gefahr für die Forscher. Bei der Verwendung von Baumwollratten ist es unerlässlich, ruhig zu bleiben. Die Ratten wurden leicht erregbar und versucht, ihren Käfig entkommen. Verwendung eines Anreicherungsrohr und nest...

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Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K Aufrufe.  McMaster University. Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model. 

Serie: Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Forschung

Medizin

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Verwaltung von onkolytischen Viren für lokoregionale von Orthotopische HCC bei Ratten

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

Die Verwendung eines Low-Flow-Digital-Anästhesiesystem für Mäuse und Ratten

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

In vivo Auswertung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Rattenzunge

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Ein präklinisches Porcine-Modell der orthotopischen Herztransplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Präklinisches Modell der Herzspende nach Kreislauftod

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...