Aufgrund ihrer hohen Effizienz kann diese Methode induzierte pluripotente Stammzellen oder IPSCs als Werkzeug zur Untersuchung menschlicher Krankheiten und zur Entwicklung neuartiger Stammzelltherapien weiter voranbringen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Fähigkeit, qualitativ hochwertige integrationsfreie IPSCs aus primären menschlichen Fibroblasten zu generieren, einschließlich schwer umprogrammieren, Krankheit assoziiert, altert und seneszierende Fibroblasten. Der Erfolg dieser Methode hängt von der optimalen RNA-Transfektionseffizienz von Fibroblasten ab.
Und die Anpassung des pH-Werts eines Transfektionspuffers ist ein schlüsselfertiges Verfahren, um dies zu erreichen. Zu Beginn bereiten Sie den Transfektionspuffer mit 500 Millilitern und 100 Milliliter Raumtemperatur vorgewärmten Flaschen mit frisch reduziertem Serummedium vor. Messen Sie den Basis-pH-Wert des Mediums in einer 500-Milliliter-Flasche, indem Sie die Glaselektrode des pH-Meters in den Puffer einsetzen, und warten Sie bis zu einer Minute, bevor Sie den pH-Wert lesen.
Um den pH-Wert einzustellen, fügen Sie drei bis vier Milliliter eines Molaren-Natriumhydroxids in eine 500-Milliliter-Flasche ein. Schließen Sie die Flasche und mischen Sie gut. Nachdem Sie fünf Minuten gewartet haben, öffnen Sie die Flasche und legen Sie die Elektrode des pH-Meters in den Puffer ein.
Warten Sie, bis sich der Messwert auf dem pH-Meter stabilisiert. Setzen Sie weiterhin kleine Volumina von einem Mol-Natriumhydroxid ein, bis der pH-Wert 8,15 bis 8,17 erreicht, und stellen Sie sicher, dass das pH-Messgerät während des Prozesses mehrmals kalibriert wird. Verwenden Sie ein 0,22 Mikrometer Vakuumfiltrationssystem, um den Transfektionspuffer zu sterilisieren.
Aliquot den sterilisierten Puffer in fünf Milliliter-Röhren mit minimalem Luftraum. Stellen Sie sicher, dass die neu zu programmierenden Fibroblasten bei 40 bis 60 % Konfluenz liegen. Übertragen Sie vier Milliliter DPBS in eine 15 Milliliter konische Röhre und fügen Sie 100 Mikroliter rekombinantes humanes Laminin 521 hinzu.
Durch Pipettieren nach oben und unten gründlich mischen. Fügen Sie einen Milliliter pro Brunnen verdünntes rekombinantes humanes Laminin 521 in drei Brunnen einer sechs Brunnenplatte. Inkubieren Sie diese beschichtete Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.
Während dieser Inkubation, warm sechs Milliliter Fibroblast enderexpansion Mittel und vier Milliliter Beschichtung mittel bis 37 Grad Celsius. Ergänzen Sie das Beschichtungsmedium mit basislichem FGF bei einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter und B18R bei einer Endkonzentration von 200 Nanogramm pro Milliliter. Sorgsam das verbrauchte Medium von Fibroblasten ansaugen, die bei 40% bis 60% Konfluenz liegen.
Spülen Sie die Zellen mit fünf Millilitern DPBS. Fügen Sie drei Milliliter Trypsin EDTA hinzu und schaukeln Sie die Platte sanft, um die Zellen mit Trypsin EDTA zu bedecken. Aspirieren Sie überschüssige Flüssigkeit, so dass etwa 500 Mikroliter Trypsin, und inkubieren Sie die Fibroblasten für drei Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach dem Entfernen der Platte aus dem Inkubator, fest, aber vorsichtig tippen Sie auf die Seite der Platte, um die Zellen zu lösen. Sehen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop an, um zu überprüfen, ob sie getrennt wurden. Fügen Sie den abgetrennten Zellen fünf Milliliter Fibroblasten-Expansionsmedium hinzu, um das Trypsin EDTA zu neutralisieren.
Sammeln Sie die Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und mischen Sie sie gut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, dann Pipette 12 000 Zellen in vier Milliliter des zuvor vorbereiteten vorgewärmten Beschichtungsmediums. Nach dem Entfernen der beschichteten Platte aus dem Inkubator, aspirieren Sie verdünntes Laminin 521 aus den Brunnen, um sicherzustellen, dass die Oberfläche der Brunnen nicht trocknet.
Setzen Sie die Zellen, die sich im Beschichtungsmedium befinden, vorsichtig wieder aus und fügen Sie jedem beschichteten Brunnen einen Milliliter Zellsuspension hinzu. Legen Sie die plattierten Zellen in einen Tri-Gas-Gewebekultur-Inkubator mit niedrigem Sauerstoff- oder Sauerstoffgehalt auf 5% und dann sanft, aber gründlich dispergieren Sie die Zellen durch Wechsel zwischen einem nach oben nach unten, dann links rechts Bewegung, und wiederholen Sie die Bewegungen zwei weitere Male, um sicherzustellen, dass die Platte nicht zu wirbeln. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
Fügen Sie in der Zwischenzeit vier Milliliter Umprogrammierungsmedium auf ein 15 Milliliter konisches Rohr hinzu und legen Sie es in den niedrigen O-Zwei-Inkubator mit einer gelockerten Kappe, um über Nacht auszubalancieren. Entfernen Sie mindestens eine Stunde vor der Transfektion das gleichgewichtiver Reprogrammierungsmedium aus einem niedrigen O-2-Inkubator. Fügen Sie bFGF zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter und B18R zu einer Endkonzentration von 200 Nanogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie sie gut.
Wenn Sie jeweils gut arbeiten, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um das verbrauchte Medium zu entfernen. Und ersetzen Sie es durch einen Milliliter Reprogrammierungsmedium, ergänzt durch bFGF und B18R. Bewegen Sie die Platte mit den Zellen zurück in den Sauerstoff-Inkubator.
Um die Fibroblastentransfektion zu starten, gleicht zunächst ein Aliquot des Transfektionspuffers für etwa eine Stunde bei Raumtemperatur aus. Entfernen Sie einen einzelnen 33 Mikroliter Aliquot modifizierter MRNAs und 14 Mikroliter Aliquot von MIRNA Imitiert von negativen 80 Grad Celsius, und erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur für etwa drei bis fünf Minuten, bis aufgetaut. Drehen Sie sie kurz in einer Mikrofuge nach unten.
Erwärmen Sie das Transfektionsreagenz etwa drei bis fünf Minuten auf Raumtemperatur. Invertieren Sie das Rohr zwei- bis dreimal, um das Reagenz zu mischen und es kurz in einer Mikrofuge nach unten zu drehen. 279 Mikroliter des Raumtemperaturtransfektionspuffers in ein RNAs freies Mikrozentrifugenrohr übertragen und 31 Mikroliter des Transfektionsreagenzhinzufügens hinzufügen.
Durch Pipettieren gründlich mischen und bei Raumtemperatur eine Minute lang brüten. Fügen Sie 132 Mikroliter des Raumtemperatur-Transfektionspuffers in den 33-Mikroliter-Aliquot modifizierten MRNA und sanft Pipette zum Mischen hinzu. Fügen Sie 102,6 Mikroliter des Raumtemperatur-Transfektionspuffers in den 14-Mikroliter-Aliquot von MIRNA-Idern und sanft Pipette zum Mischen hinzu.
Um den Transfektionsmix aus modifiziertem MRNA vorzubereiten, fügen Sie 165 Mikroliter des 310 Mikroliter-Transfektionspuffers, Transfektionsreagenz-Mix, zu 165 Mikrolitern des Transfektionspuffers hinzu, modifizierte MRNA-Mischung. Pipette zu mischen. Um den Transfektionsmix von MIRNA-Mimik zu erstellen, fügen Sie 116,6 Mikroliter des 310 Mikroliter-Transfektionspuffers, Transfektionsreagenz-Mix, zum 116,6 Mikroliter-Transfektionspuffer, MIRNA-Mimik-Mix hinzu.
Gut mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren, damit sich der Transfektionspuffer mit den modifizierten MRNAs und MIRNA-Imiden komplexieren kann. Entfernen Sie die Platte mit Zellen aus dem Sauerstoff-Inkubator. Lassen Sie klug über jeden Brunnen, fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen der Transfektionsmischung, die die komplexen, modifizierten MRNAs enthält.
Sanft, aber gründlich rühren Die Platte mit einem nach oben nach unten, dann links rechts Bewegung, um die Transfektionskomplexe zu zerstreuen. Fügen Sie 66,7 Mikroliter pro Brunnen des Transfektionsmixes hinzu, der die komplexen MIRNA-Mimiks enthält, die weise über jeden Brunnen fallen. Sanft, aber gründlich rühren Die Platte mit einem nach oben nach unten, dann links rechts Bewegung, um die Transfektionskomplexe zu zerstreuen.
Legen Sie die Platte mit den transfizierten Zellen mit niedrigem Sauerstoffgehalt in den Tri-Gas-Inkubator. Dispergieren Sie die Transfektionskomplexe, indem Sie die Platte sanft, aber gründlich mit einer nach oben nach unten, dann links rechts Bewegung rühren. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen im Inkubator 16 bis 20 Stunden, bevor Sie am nächsten Tag das Medium wechseln.
Fügen Sie vier Milliliter Umprogrammierungsmedium auf eine 15 Milliliter konische Röhre hinzu und legen Sie es in den niedrigen O-Zwei-Inkubator mit einer gelockerten Kappe, um sie über Nacht auszubalancieren. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das mit bFGF und B18R ergänzte Konvektionsmedium durch das frische vorausgeglichene Medium und setzen Sie das im Protokoll beschriebene Transfektionsschema fort. Nach erfolgreicher Beschichtung in einen Brunnen einer sechs gut Formatschale für die Umprogrammierung, Fibroblasten erschienen sehr spärlich.
24 Stunden nach der ersten erfolgreichen Transfektion verloren Fibroblasten ihre Spindelform und nahmen eine abgerundetere Morphologie an. Während der ersten drei Transfektionen nahm die Zelldichte allmählich und konsequent zu, wobei die Proliferation zwischen den Tagen sieben und acht offensichtlich platzte. Am 10. Tag erschienen die Zellen weitgehend konfluent.
Die ersten IPSC-Kolonien erschienen bereits am 11. Tag. An den Tagen 15 bis 17 wurden IPSC-Kolonien groß und offensichtlich und deutlich von umgebenden und vollständig umprogrammierten Fibroblasten. Die Immunostainierung für den Pluripotenzmarker TRA-1-60 bestätigte eine hohe Reprogrammierungseffizienz.
Die suboptimale Beschichtungsdichte ist der häufigste Grund für die reduzierte Effizienz der Neuprogrammierung in diesem Protokoll. Wenn die Beschichtungsdichte zu gering war, traten große azelluläre Baronpflaster auf und IPSC-Kolonien bildeten sich nicht. Nach dem Verdünnungsdurchgang umprogrammierter Zellen wuchsen IPSCs als einzelne Kolonien und waren leicht von Fibroblasten zu unterscheiden.
Sie waren lose verpackt und einzelne Zellen hatten einen relativ großen zytoplasmatischen Bereich. Im Laufe von vier bis sieben Tagen vermehrten sich die IPSCs und bildeten eine charakteristische, eng gepackte Kolonie mit definierten Kanten. Einzelne Zellen innerhalb der Kolonie zeigten eine große Kernfraktion mit prominenten Nukleoli.
Nach der Neuprogrammierung von Patienten-Fibroblasten können die resultierenden IPSCs in eine Vielzahl somatischer Zellen differenziert werden, um krankheitsverursachende Mechanismen aufzuklären oder neuartige regenerative zellbasierte Therapeutika zu entwickeln.
