Intrazelluläre Bakteriengemeinschaften, oder IBCs, wurden bei Mäusen beobachtet, die experimentelle Harnwegsinfektionen erhalten haben, oder UTIs. Sie wurden auch in den Urinsedimenten menschlicher UTI-Patienten gesehen. Die Technik, die wir heute beschreiben, ist eine Möglichkeit, einzelne IPCs von experimentell infizierten Mäusen zu isolieren.
Die Mund-Mikropipetting-Technik ist die einzige derzeit verfügbare Technik zur Isolierung intrazellulärer Bakterien aus infizierten Mausblasen. Um Glasmundpipetten vorzubereiten, kneifen Sie beide Enden eines Glaskapillarrohres fest und drehen Sie die Mitte des Rohres entlang seiner Achse gleichmäßig über eine offene Flammenquelle hin und her. Wenn das Glas weich wird, entfernen Sie die Kapillare von der Wärmequelle und ziehen Sie das Glas sofort auseinander.
Die ideale Endlänge der gezogenen Kapillare ist drei bis fünf Zentimeter länger als eine ungezogene Kapillare, um einen geeigneten Innendurchmesser für die Isolierung einzelner Blasenepithelzellen zu gewährleisten. Wenn das Glas abgekühlt ist, überprüfen Sie, ob die Mitte der Glaskapillare schmaler ist und ob das Innere des Rohres noch hohl ist. Nehmen Sie das große Ende der gezogenen Kapillare mit einer Hand, verwenden Sie Zange, um die Kapillare an ihrer engsten Stelle zu greifen, um sicherzustellen, dass die Zange mit genügend Kraft ausgeübt wird, um die Kapillare fest zu greifen, ohne sie zu zerquetschen.
Drehen Sie die Zange schnell, um die gezogene Kapillare an der engsten Stelle zu schnappen. Dann legen Sie den Mund Mikropipette-große Kapillare in eine 100-Millimeter-Petrischale und UV sterilisieren die Schale für 30 Minuten. Um die Blase zu ernten, legen Sie eine Maus in die Rückenposition und sterilisieren Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.
Mit Ethanol-sterilisierten Zangen und chirurgischen Scheren, machen Sie einen anfänglichen ein Zentimeter quer Hautschnitt über der Harnröhrenöffnung und erweitern Sie den Schnitt diagonal in Richtung der oberen Gliedmaßen der Maus, um einen V-förmigen Schnitt entlang der gesamten Vorderseite der Maus zu schaffen, der den Inhalt des Peritoneums freilegt. Mit neuen sterilisierten Werkzeugen, drücken Sie vorsichtig auf die Fettpolster in der Nähe der Beckenregion der Maus, um die Blase zu protrukern und greifen Sie die exponierte Blase an der Spitze. Halten Sie einen festen Griff auf die Blase, schneiden Sie die Harnleiter und Harnröhre, um die Blase zu befreien und legen Sie die Spitze einer Welle von abgerundeten Zangen in die Öffnung der Blase, wo es gerade eingeschnitten wurde.
Lassen Sie die Zangen, die den Scheitelgreifen und halten Sie die abgerundeten Zangen fast vollständig geschlossen, verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um das äußere Ende des Mundes der Blase sanft weg von den abgerundeten Zangen und um und über die andere Spitze der abgerundeten Zange zu ziehen, um die Blase nach innen zu drehen. Verwenden Sie dann das zweite Zangenpaar, um die invertierte Blase von der Spitze der Zange sanft in einen Milliliter kalten PBS zu verwandeln. Und kratzen Sie vorsichtig die innere Epithelzellschicht auf der Außenseite der invertierten Blase mit zwei Paaren sauberer Zangen.
Wenn alle Zellen abgekratzt sind, legen Sie das ungezogene Ende einer gezogenen Glaskapillare in den Gummistopfen eines Saugrohrs und passen Sie das schmale Ende einer ein Milliliter-Pipettenspitze fest in das andere offene Ende des Rohres. Das schmale Ende einer zwei Milliliter-Saugpipette fest in das offene, breitere Ende der ein Milliliter Pipettespitze einbauen und die abgekratzte Zellsuspension unter ein Sezierendes Mikroskop legen. Identifizieren Sie die IBCs mit einer 20- bis 40-fachen Vergrößerung als große fluoreszierende Aggregate und tauchen Sie das feine Ende der Glaskapillare für eine Sekunde in ein frisches Rohr von PBS, um die Aufnahme unerwünschten Volumens durch Kapillarwirkung zu reduzieren.
Wenn ein IBC von Interesse gefunden wurde, bringen Sie langsam das offene Ende des Kapillarrohres in Richtung des IBC und wenden Sie eine sehr kleine Saugkraft auf die Ansaugpipette an, um die IBC in die Glaskapillare zu führen. Dann bewegen Sie die Kapillare auf ein leeres 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und wenden Sie einen leichten positiven Druck an, um das Tröpfchen und den IBC in das Rohr zu vertreiben. Neben der Bestätigung des Vorhandenseins eines einzelnen isolierten IBC im Sammelrohr über das Sezierendes Mikroskop kann die Reinheit des isolierten IBC durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden.
Die isolierten Zellen sollten sowohl für E.coli als auch für Uroplakin färben und zwischen 50 und 120 Mikrometer groß sein. Nach der Isolierung kann das Vorhandensein und die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen in den einzelnen IBC durch koloniebildende Einheitsquantifikation oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion für genomische Äquivalente bestätigt werden. Insbesondere zeigen nicht infizierte Epithelzellen, die mit demselben Protokoll isoliert sind, keine quantifizierbaren Mengen an Bakterien.
Darüber hinaus bestätigt die quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse das Vorhandensein von bakteriellen Genen in einer Reihe von individuell isolierten und gepoolten IBCs. Stellen Sie immer sicher, dass eine Mundmikropipette Flüssigkeit leicht aufnehmen und vertreiben kann. Zögern Sie nicht, die Kapillare oder das gesamte Gerät zu wechseln, wenn sich die Mundmikropipette verschlossen anfühlt.
Diese Mund-Mikropipetting-Technik ermöglicht es uns, die intrazellulären Populationen, die sich während einer experimentellen UTI bilden, direkt und spezifisch zu untersuchen. Ohne diese Technik wären diese intrazellulären Populationen mit den extrazellulären Bakterien kontaminiert und in der Überzahl. Einige andere Infektionserreger können leichter aerosolisiert oder übertragen werden als die E.coli, die wir in dieser Anwendung verwendet haben.
In diesen Fällen können daher einige zusätzliche Kontrollen gerechtfertigt sein, z. B. das Hinzufügen eines Filters oder das Erweitern der Schläuche, je nach verwendeter Anwendung. Die mit dieser Mund-Mikropipetting-Technik isolierten IBCs können dann in anderen nachgeschalteten Einzelzellanalysen wie QRTPCR oder RNA-Sequenzierung eingesetzt werden.
