Die Autoren bedanken sich bei Shelly Xie und Jennifer Payne für ihre technische Unterstützung durch Experten bestätigt. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem Society of Pediatric Urology und der Stanford Pediatric Research Fund.

I. Vorbereitung der Harnröhren-Katheter <ol><li> Für jede Maus Blase und Niere entnommen werden, statt 5-6 Edelstahlkugeln (Blase, 1,6 mm Größe oder 0,9-2,0 mm Blend) oder Zirkonoxid-Perlen (Niere, 0,5 mm Größe) in einem Kryoröhrchen Rohr bzw.. Autoclave die Perle enthaltenden Röhrchen. </li><li> Nach der Rohre auf Umgebungstemperatur abkühlen, 200 Mikroliter steriles PBS zu jeder Edelstahl bead-haltigen Schlauch und 400 Mikroliter steriles PBS in jedes Zirkonoxid bead-haltigen Röhre. </li><li> Wir bereiten Harnleiterkatheter wie Hung und Hultgren 13 beschrieben. Autoclave ein sauberes Paar Flat-Head-Pinzette und einer feinen Schere (Iris oder ähnliches) und erlauben die Instrumente auf Raumtemperatur abkühlen. Wischen Sie die Oberflächen einer Sterilbank mit 70% Ethanol. In der Haube, schneiden Sie ein 30 cm (ca.) Segment der PE-Rohre. Aseptischen Bedingungen statt einer sterilen 30-Gauge-Nadel (2.1 inch lange Nadel) auf einer sterilen 3 ml Spritze. Pick-up ein Ende des Schnittes Polyethylen-Schlauch mit dem autoklaviert Zange und schieben Sie den Schlauch auf die Nadel bis sie den Hub erfüllt. Schneiden Sie den Schlauch so, dass ca. 2 cm über die Spitze der Nadel erstreckt. Entfernen Sie den Katheter aus der Spritze und in eine sterile Petrischale. </li><li> Zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination, machen wir einen Katheter, der für jede Maus. Nachdem alle Katheter vorgenommen werden, sterilisieren durch die Exposition in einer ungedeckten Petrischale UV-Bestrahlung für mindestens 30 Minuten. Schauen Sie nicht direkt an UV-Lampen und setzen jeden Teil des Körpers in der Haube, während Lampen aktiviert werden. Nach UV-Bestrahlung kann Katheter langfristig aufbewahrt in der Petrischale werden. Wir empfehlen Abdichtung der Schale mit Parafilm zu helfen, der Aufrechterhaltung der Sterilität. </li></ol> II. Tierversuch <ol><li> Mäuse ankommen sollten mindestens eine Woche vor dem experimentellen Manipulation, um Stress-induzierten Störfaktoren zu vermeiden. Weibliche Mäuse werden verwendet, weil die männliche Harnröhre Maus ist extrem schwierig, einen Katheter. CBA / J ist ein häufig genutzt, UTI-anfällig Inzucht Mausstamm. Mäuse sollte zwischen 8 und 12 Wochen alt werden, denn dies ist das Fenster der immunologischen Reife vor Seneszenz. Am ersten Tag des Experiments, tauchen am Ende einer sterilen Impföse in ein Fläschchen mit gefrorenen Bakterien Lager. Abkratzen ein kleines Inokulum und Streifen auf einem geeigneten Agarplatte. Generell uropathogene E. coli (UPEC) und andere Stämme können über Nacht auf Luria-Bertani (LB)-Agar bei 37 ° C in der Umgebungsluft. UPEC Stämme wachsen als feste, gelblich-weiße durchscheinende Kolonien auf LB-Agar. Sofort wieder die bakterielle Lager in den Gefrierschrank. Uropathogene Bakterienstämme können sich weniger virulent im Laufe der Zeit mit wiederholten, Serials Kulturen. Wir empfehlen daher, Schlieren eine frische Agarplatte für jedes Experiment. </li><li> Am Tag 2 des Experiments, nach der Bestätigung richtige Koloniemorphologie, nehmen einzelne Kolonien von Agarplatten und in mindestens 5 ccm Bouillonkultur Nacht. LB-Medium kann für die meisten uropathogene Bakterienstämmen verwendet werden können (37 ° C, 200 rpm in der Luft). Halten Sie die Verschlusskappen locker auf der Bouillonkultur Rohre Belüftung zu ermöglichen. </li><li> Am Tag 3 des Experiments, nehmen 10% der ersten Bouillonkultur und Kultur in der Brühe über Nacht wieder (in der Regel 37 ° C und 200 rpm), um Typ-I-Pili Expression zu verstärken. Serielle Brühenkulturen helfen, bakterielle uropathogenicity optimieren, da Typ-I-Pili haben gezeigt worden, um eine kritische Virulenzfaktor für uropathogens in vivo 1 sein. Halten Sie die Verschlusskappen locker auf der Bouillonkultur Rohre Belüftung zu ermöglichen. </li><li> Am Tag 4 des Experiments, messen Sie die OD 600 der Bouillonkultur von Tag 3. Wenn nicht schon für den Bakterienstamm getestet bekannt, führen Sie das Zehnfache serielle Verdünnungsausstrichtest über mindestens 7 Logs (Verdünnungen mit PBS durchgeführt, Kulturen auf LB-Agar durchgeführt, 37 ° C Inkubation über Nacht), um die Beziehung zwischen OD 600 und cfu bestimmen / ml. Als Faustregel gilt, dass eine OD 600 von 0,4-0,5 allgemein entspricht 1-2x10 7 cfu pro 50 Mikroliter. Nachdem die Beziehung zwischen OD 600 und KBE / ml festgestellt worden ist, kann man die Brühe Kultur der OD 600 entsprechend der gewünschten KBE pro Maus in 50 Mikroliter PBS anpassen. Einige Arbeiten hat vorgeschlagen, dass Inokulation von 10 Mikroliter, anstatt 50, auf weniger Rücklauf in die kidneys6 führt. Allerdings haben die meisten Publikationen Verwendung von 50 Mikroliter pro Maus berichtet. Generell wird die gewünschte cfu liegt zwischen 10 6 und 108 KBE / Maus, aber jeder bakteriellen / Mausstamm Kombination muss empirisch in vivo getestet werden. </li><li> Um sicherzustellen, dass Inokula sind nicht sofort nach der Anwendung ungültig, sollte Mäuse von Wasser für mindestens 30 Minuten vor der Einleitung einer Vollnarkose nicht entzogen werden. Ein weiteres wichtiges Manöver ist zu veranlassen Blasenentleerung vor der Narkose-Induktion durch schnappen Mäusen und leichtes Drücken auf die untere Abdomen. Zwei bis 2,5% Isofluran ist eine sichere Induktionsdosis für 8-12 Wochen alte weibliche CBA Mäusen, durch Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,8-2% Isofluran gefolgt. </li><li> Sobald Anästhesie erreicht ist, werden die Mäuse in Rückenlage mit dem Kopf in einem nosecone an Isofluran-Sauerstoff eingesetzt platziert. Der Unterleib ist massiert, um Urin aus der Blase zu evakuieren. Wenn die Blase ist relativ leer, so kann dieses Manöver nicht nachgeben Urin. Der Unterleib und Damm ist mit 70% Ethanol getränkt. </li><li> Eine sterile 1 ml-Spritze ohne Nadel dient zur Erstellung der gewünschten bakteriellen Inokulums. Als nächstes wird eine sterile Harnröhrenkatheter aseptisch auf die Spritze gesetzt. Die überschüssige Schlauch ist aus der Katheter mit einer Schere geschnitten, so dass nur 1-2 Millimeter der Schläuche distal der Spitze der Nadel bleiben. Dann wird die Spritze abgenommen und der Kolben mit der Spritze aufrecht, um alle Luftblasen zu entfernen deprimiert. Ein Klacks bakteriostatische Gleitgel ist auf eine sterile Petrischale oder der Innenseite der sterilen Spritze Wrapper gespritzt. Die Spitze des Katheters (mit angeschlossenem Spritze) ist in das Gelee getaucht. Wenn mehrere Bakterienstämme in das gleiche Experiment getestet werden, darauf achten, nicht den gleichen Tropfen Gelee verwenden, um Katheter mit verschiedenen Stämme zu schmieren. </li><li> Mit einem Stereo-Mikroskop (0.8x bis 5fach-Zoom-Bereich) für die Vergrößerung, ist die Vorhaut der Klitoris der narkotisierten Maus sanft in der nicht-dominanten Hand mit einem Paar feinzahnigen Pinzette gefasst und angehoben kopfwärts auf die dunkelrosa Urethraöffnung aussetzen ( Abbildung 1). Die Spritze (mit angeschlossenem Katheter) wird in der dominanten Hand mit einem Bleistift Grip erfassen und die Spitze des Katheters wird in der Harnröhre in einem 45 Grad-Winkel engagiert. Die Vorhaut der Klitoris entlang der Längsachse der Spritze gespannt ist, effektiv &quot;Laden&quot; die Harnröhre auf den Katheter. Dieses Manöver ist wichtig, da die Maus Harnröhre ist redundant. Der Katheter sollte sich leicht in die Blase (bis auf die Nabe, Bild 2) und kann sanft wirbelte um die Navigation der redundanten Falten der Harnröhre. Sobald der Katheter hubbed, kann die Spritze abgesenkt, bis sie parallel mit der Längsachse der Maus ist. Die nicht-dominante Hand fallen kann die Zange zur Stabilisierung der Position des Katheters und Spritze auf wie die dominante Hand wird verwendet, um langsam zu injizieren das Inokulum (mindestens 5 Sekunden). Wenn Flüssigkeit gesehen fließt um den Katheter während der Injektion, ist entweder die Blase voll ist oder die Katheter wird in die Vagina (nur kaudal der Harnröhre). Die Injektion sollte sofort gestoppt werden und die Position des Katheters sorgfältig geprüft. Wenn der Katheter in der Harnröhre, sollte die angegebene Maus nicht in das Experiment einbezogen werden. Auf der anderen Seite kann ein Katheter in die Vagina verlegt neu positioniert werden und die Injektion wieder versucht. Nach der Injektion wird der Katheter und Spritze langsam von der Maus gezogen. </li><li> Zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit des frühen post-Impfung ungültig erklären, die verabreichten Bakterien evakuieren können und dadurch variable Infektionsraten führen, halten einige Forscher Mäusen unter Narkose für 30 Minuten nach transurethralen inoculation10. Nach der Operation sollte Mäusen auf eine saubere wärmende Decke mit kontinuierlicher Beobachtung wieder zur Rückkehr der normalen Atmung und Aktivität zu bestätigen. Sobald Tiere haben völlig die Fähigkeit zu kriechen erholt, können sie auf Betten-haltigen Käfige zurückgebracht werden. </li></ol> III. Mess-CFU in infiziertem Gewebe <ol><li> Verschiedene Maus UTI Publikationen zu Kultur Ergebnisse von 6 Stunden bis eine Woche oder länger nach der Impfung berichtet. Der optimale Zeitpunkt Punkte müssen empirisch für jede bakterielle / Mausstamm Kombination bestimmt werden. Gelassene Urin ist für die Kultur schnappen Maus über eine sterile Petrischale erhalten. Gesammelten Urin sollte auf Eis zu jeder Zeit eingehalten werden. Mehrere Versuche, gelassene Urin über viele Stunden erhalten kann es notwendig sein, da Maus Blasenentleerung ist häufig, geringes Volumen (30-100 Mikroliter pro void) und Stress-abhängig. </li><li> Nach Erhalt ungültig Urinproben, opfern wir Mäuse mit Isofluran und Genickbruch. Der Bauch ist aseptisch geöffnet. Wenn eine gelassene Urin Probe wurde nicht erfolgreich gewonnen erwähnt, kann eine kleine Menge von Urin oft durch die Blasenwand mit einer 30-Gauge-Nadel und Spritze abgesaugt werden. </li><li> Eine oder beide Nieren entfernt werden, Hackfleisch in mindestens 4 Stück (je Stück sollte weniger als 50 Mikrogramm) auf einer sterilen Petrischale, und legte in Zirkon Perlen / PBS-haltigen Kryoröhrchen auf Eis. Die Blase wird entfernt, fein gehackt in mindestens 4 Stück, und legte in Edelstahl Perle / PBS-haltigen Kryoröhrchen auf Eis. Das Gewebe / Perlen / PBS-haltigen Kryoröhrchen werden in a Bullet Blender Homogenisator gegeben und das Gewebe homogenisiert mit der &quot;8&quot; Geschwindigkeit für 1 Minute. Es ist üblich, für einige Gewebestücke nach der Homogenisierung bleiben. Solange 50-100 Mikroliter Flüssigkeit Homogenat pipettiert werden kann, feste Fragmentesind nicht unbedingt ein Problem. Wenn Homogenisierung Zeit für ein paar Proben erhöht wird, ist es wichtig, dies zu tun für alle Gewebe, um die Konsistenz der Homogenisierung zu halten. Wir verwenden a Bullet Blender homogenisiert, weil es die Möglichkeit einer Kreuzkontamination vermieden wird, ist schneller als die Verarbeitung einzelner Proben nacheinander mit einem Standard-Homogenisator, und nicht wesentlich erwärmen die Proben homogenisiert. </li><li> Mindestens zwei oder drei zehnfachen Verdünnungen der gesammelten Urin und Gewebehomogenaten sollte in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Für Vorversuche kann es ratsam, mindestens sieben Zehnfache Verdünnungen machen. Kultur bis zu 100 Mikroliter Urin, Blasen-und / oder Nieren-Homogenaten auf geeigneten Agar. Da Urinproben können Volumen-begrenzt, kann es notwendig sein, um ihr Volumen auf 100 Mikroliter vor zu bringen, um die Durchführung Zehnfache Verdünnungen. Wenn dies erforderlich ist, wird die anfängliche Verdünnung (vor zehnfachen Verdünnung) müssen in die endgültige Berechnung der bakteriellen Erträge berücksichtigt. Wir bevorzugen Kultivierung UPEC auf Eosin-Methylenblau oder MacConkey Agar (Inkubation über Nacht bei 37 ° C), da diese Medien für Gram-negative Organismen selektiv. UPEC Stämme wachsen auf MacConkey Agar als zentral genabelt, rot-rosa Kolonien aufgrund ihrer Fähigkeit, Laktose zu fermentieren. </li><li> Nach Übernacht-Kultur, zählen die cfu für jede Platte. Für seriell verdünnten Proben wird die Platte Verdünnung mit 50-100 Kolonien als die genaueste Zählung. &quot;Zurück&quot;-Berechnung KBE pro Gewebe pro Milligramm Gewebe oder pro ml. </li></ol> IV. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Harnröhre (dunkelrosa Gewebe) durch Anheben Klitorisvorhaut mit einer Pinzette (jenseits oben Foto) kopfwärts ausgesetzt <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Harnröhre katheterisiert. Die gespaltene Klitoris kann direkt über den Katheter zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Bladder cfu zählt 2 Tage nach der transurethralen Infektion von 8 Wochen alte weibliche CBA / J-Mäusen mit uropathogene E. coli. Blasen wurden homogenisiert und KBE / ml bestimmt durch serielle Verdünnung Plattierung auf MacConkey Agar. Diamanten weisen KBE / ml für einzelne Mäuse, zeigt Reck Median KBE / ml.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Die Induktion der Maus Harnwegsinfektion durch transurethrale Inokulation von Bakterien ist eine seit langem etablierte, aber technisch anspruchsvollen Verfahren 11. Hung und Hultgren kürzlich veröffentlichten einen ausgezeichneten Überblick über transurethralen Techniken der Maus Harnwegsinfektion 13. In diesem Papier versuchen wir, weiter zu veranschaulichen, die Feinheiten dieser experimentelle Ansatz. Anfänger können ihre Technik, indem Sie eine Mittellinie La...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Uropathogene Bakterienstämme von Interesse sind, auf Agar gewachsen. Generell uropathogene<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) und andere Stämme können über Nacht auf Luria-Bertani (LB)-Agar bei 37 ° C in der Umgebungsluft. UPEC Stämme wachsen als gelblich-weiße durchscheinende Kolonien auf LB-Agar. Nach der Bestätigung der entsprechenden Koloniemorphologie sind einzelne Kolonien griff dann in Brühe gezüchtet werden. LB-Medium kann für die meisten uropathogene Bakterienstämmen verwendet werden können. Zwei serielle, über Nacht LB Bouillon-Kulturen eingesetzt, um die Expression von Typ-I-Pili, eine gut definierte Virulenzfaktor für uropathogene Bakterien zu verbessern. Bouillon-Kulturen sind auf die gewünschte Konzentration in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Acht bis 12 Wochen alte weibliche Mäuse werden unter Isofluran-Narkose gelegt und transurethral mit Bakterien mit Polyethylen-Rohr bedeckt 30-Gauge-Spritzen geimpft. Typische Inokula, die empirisch für jede bakterielle / Maus-Stamm-Kombination ermittelt werden, sind 10<sup&gt; 6</sup&gt; Bis 10<sup&gt; 8</sup&gt; KBE pro Maus in 10 bis 50 Mikroliter PBS. Nachdem die gewünschte Infektion Zeitraum (ein Tag bis zu mehreren Wochen), Urinproben und der Blase und beide Nieren entnommen. Jedes Organ ist Hackfleisch, platziert in PBS und homogenisiert in einem Blue Bullet Homogenisator. Urin-und Gewebehomogenaten werden seriell in PBS verdünnt und über geeignete Agar. Am nächsten Tag sind koloniebildende Einheiten gezählt.

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Dieses Video demonstriert Methoden zur transurethral induzieren Maus Harnwegsinfektionen und zu quantifizieren, das Ausmaß der daraus resultierenden Infektionen.

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.4K Aufrufe.  Stanford University. Dieses Video demonstriert Methoden zur transurethral induzieren Maus Harnwegsinfektionen und zu quantifizieren, das Ausmaß der daraus resultierenden Infektionen.

Serie: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis in SJL Mäuse

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

Transurethrale Instillation Verfahren bei erwachsenen männlichen Maus

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Induktion der Maus Lungenverletzung durch Endotracheal Injektion von Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...