Dieses Projekt wurde gefördert durch die National Institutes of Health unter GM018568. Dieses Protokoll wurde teilweise in der Mitte für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, die von der National Science Foundation unter NSF Award Nr. 1541959 unterstützt wird. CNS ist Teil der Harvard University. Vielen Dank gebührt Thomas Norman und Nathan Herrn für ihre Arbeit bei der Konzeption und Herstellung der Mastervorlage für die Geräte gezeigt, hier und in den Aufbau der ursprünglichen Version des Geräts verwendet. Wir auch vielen Johan Paulsson für seine wertvolle gemeinsame Beratung und vielen Mitglieder von seinem Labor für ihre Ratschläge und weitere Verbesserungen zu bakteriellen mikrofluidischen Apparate.

(1) PDMS Gerät Casting
<ol><li>In einer staubfreien Umgebung PDMS Polymer und Härtemittel im Verhältnis 10:1 mischen und unter Vakuum für mindestens 10 Minuten entgasen.</li>
	<li>Legen Sie ein Silizium-Meister (oder eine Epoxid oder Polyurethan Nachbildung davon) auf ein Stück Alufolie ungebrochen in einem Polystyrol Petri-Platte. Den Teig entgast PDMS über den Master bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm. Degas die Petri-Platte für mindestens 10 Minuten Nutzung eines sanften Luftstrom Oberfläche Bläschen zu brechen. Hinweis: Die Abmessungen des Gerätes zwei Ebenen werden zur Verfügung gestellt im zugehörigen CAD Datei5 (siehe ergänzende Datei 1). Ein plastische Nachbildung Master kann teilweise während der Entgasung schweben; in diesem Fall drücken Sie das Replikat mit eine saubere Kunststoff-Applikator.</li>
	<li>PDMS für mindestens 1 Stunde im Ofen bei 60 ° C zu heilen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Entfernen Sie die Master- und ausgehärteten PDMS aus der Petri-Platte mit Aluminium-Folie. Die Aluminium-Folie von der Rückseite des Meisters ziehen Sie vorsichtig ab, dann ziehen Sie vorsichtig die PDMS vom Master. Hinweis: Alternativ können PDMS über Nacht bei Raumtemperatur geheilt werden. Die relative Zerbrechlichkeit eines Silizium-Wafer-Master kann überwunden werden, indem mit Epoxy Klebstoff dauerhaft binden den Wafer zu einem 1/16-Zoll-dicken Aluminiumscheibe von der gleichen Größe wie der Wafer.</li>
	<li>Ein Wafer in der Regel mehrere mikrofluidischen Geräte mit leicht unterschiedlichen Dimensionen umfasst (siehe ergänzende Datei 1), ein einziges Gerät mit einem sauberen, scharfen Skalpell Größe geschnitten. Hinweis: Für Routine B. Subtilis arbeiten, verwenden Sie Geräte mit 1,0 µm breite Zelle Gräben, die mit einem C oder F in der zugehörigen CAD-Datei markiert sind.</li>
</ol>2. Gerät Stanzen und kleben
<ol><li>Ort ein Stück transluzent Büro mit Klebeband (siehe Tabelle der Materialien) über die gemusterte Seite des Geräts, um die Sichtbarkeit der gemusterten Features zu verbessern. Die Einlass und Auslass Ports werden als Kreisflächen an den entgegengesetzten Enden der sichtbaren fluidische Kanäle (Abbildung 1) identifiziert. Um ihre Sichtbarkeit zu verbessern, beim Stanzen von Löchern in das Gerät für den Einlass und Auslass Pins, markieren Sie die ein- und Ausläufe mit Punkten mit einer feinen Spitze Marker. Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Einlass und Auslass Pins nicht überfüllt sind, wird jeder andere Kanal gelocht beginnend mit den Kanal direkt unter dem alphabetischen Bezeichner für das Gerät.</li>
	<li>Das PDMS-Gerät drehen, so dass die Dekorseite nach unten ist, und durch das Gerät zu den markierten Punkten eine 0,75 mm Biopsie-Punch mit Punsch; entsorgen Sie die Ausstanzungen. Hinweis: Die Geräte sind mit der Dekorseite nach unten schlug, weil das Loch durch die Biopsie-Punch erzeugt in der Regel leicht ausgestellte ist wo der Stempel des Polymers betritt. Stanzen das Gerät in eine umgekehrte Orientierung sorgt dafür, dass das Loch auf die Dekorseite eine scharfe Grenze hat.</li>
	<li>Mit einem Stereomikroskop, sicherzustellen Sie, dass die gestanzten Löcher überschneiden sich mit den Einlass und Auslass des Gerätes. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette, um keine überflüssigen Fragmente von PDMS aus gestanzten Löcher zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie Klebeband, um Staub von beiden Seiten des Geräts und des Ortes in einer sauberen Polystyrol Petri-Platte zu entfernen. Bereiten Sie ein Deckglas 22 x 40 mm, durch Benetzung mit 100 % Isopropyl-Alkohol und rieb mit einem Reinraum abwischen; trocken mit einem Strom von staubfreie Luft oder Stickstoff.</li>
	<li>Stellen Sie die gestanzte PDMS Gerät Funktion Seite nach oben zusammen mit dem gereinigten Deckglas in einem Sauerstoffplasma sauberer.<ol>
<li>Plasma-Behandlung das Gerät mit den folgenden Einstellungen: Vakuum, 70 mTorr; O2 Druck, 200 mTorr; Dauer, 15 s; macht, sofort nach Abschluss die Plasma-Behandlungsdauer 30 W. Gerät und Deckglas aus dem Plasma Reiniger entfernen.</li>
		<li>Invertieren Sie der PDMS und legen Sie es auf das Zentrum der Glasabdeckung, so dass die Dekorseite das Glas berührt; Stellen Sie sicher, dass die Fütterung Kanäle (laufen zwischen den Einlass und Auslass) mit der Längsachse der Glasabdeckung ausgerichtet sind. Drücken Sie sehr sanft, um sicherzustellen, dass die PDMS Dichtungen gegen das Glas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Backen Sie das montierte Gerät in einem Ofen für mindestens 1 h bei 60 ° C. Nach dem Backen, manuell überprüfen Sie, ob die PDMS auf das Glas verklebt wird, indem man vorsichtig an einer Ecke des Geräts. Hinweis: Sobald das Gerät verbunden ist, sollte es innerhalb von 24 h verwendet werden wie das Polymer wird zunehmend hydrophobe mit zunehmender Zeit nach Plasmabehandlung.</li>
</ol>(3) mikrofluidischen Sanitär-Vorbereitung
<ol><li>Schnittlängen Sie Polymer Schläuche (Innendurchmesser (ID) 0,02 Zoll Außendurchmesser (OD) 0,06 Zoll) passenden Längen von der Spritzenpumpe der Vermittlungsvorrichtung zu erreichen, um (falls verwendet) und das Gerät auf das Mikroskop montiert. Schnittlängen Sie so viele mikrofluidischen Gassen gibt.</li>
	<li>Montieren Sie Y Kreuzungen für Quetschventile (falls verwendet) durch Schneiden und Anbringen von 2 cm Länge des flexiblen Silikon Schläuche (0,03 Zoll ID, 0,065 Zoll OD) an der oberen Widerhaken des "Y" und 1 cm Länge der Silikonschlauch auf der unteren Widerhaken des "Y".</li>
	<li>10 cm (oder geeigneten) Schnittlängen von Polymer-Schläuche; verbinden Sie sie mit einem Ende an der Switch-Verzweigung durch Einfügen in die 1 cm Silikon Schlauch Segmente auf der unteren Widerhaken des "Y". Schließen Sie sie an das andere Ende an 21G Nadeln, die von ihren Kunststoffspritze Adapter und gebogen ca. 90 ° etwa 9 mm vom Ende der Nadel entfernt wurden.</li>
	<li>Schließen Sie 21G stumpfe Nadeln an einem Ende der Röhre Segmente, die von den Spritzen auf den Schalter-Apparat ausgeführt wird, indem man die Nadeln in den Schlauch an. Legen Sie die anderen Enden jeder Länge von Schläuche in Silikon Schlauch Segmente auf den Einlass Widerhaken der Y-Kreuzungen. Hinweis: Verwenden Sie irgendeine Art von Apparat, um Quetschventile und Abzweigungen in Position zu halten; Dies kann leicht von einer Mikropipette Tip Box (Abb. 2D) erfolgen.</li>
	<li>Schnittlängen von Polymer-Schläuche, Abfälle aus der Steckdose des Geräts zu einem Abfall-Becher zu tragen. Verbinden Sie sie mit einem Ende an gebogenen 21G Nadeln vorbereitet, wie oben beschrieben. Kleben Sie das andere Ende der Rohre in einem Abfall-Becher.</li>
	<li>Bereiten Sie entsprechende Mengen an Medien mit 0,1 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen Sie die gewünschte Größe und Anzahl der Spritzen. Verbinden Sie die BSA geladen Spritzen an den vorbereiteten 21G Nadeln befestigt, die Einlass Schlauch und Ladung Spritzen in Spritzenpumpen. Hinweis: für typische Experimente, die 5 Kanäle des Gerätes verwendet werden, jeweils mit einer 20-mL-Spritze. Ein Experiment, in dem das Medium gewechselt ist, erfordert 2 Bänke 5 Spritzen. Hier die Pumpe mit der erste Bank nennt man die Phase-1-Pumpe und die Pumpe mit der zweiten Bank, mit dem Post-Schalter-Medium wird als die Phase-2-Pumpe bezeichnet.</li>
	<li>Luft von der Einlass-Sanitär entlüften, durch Ausführen der Spritzenpumpen mit einer high-Flow-Rate (> 500 µL/min), beginnend von der Spritzenpumpen vertikal ausrichten und durch Tippen auf die Spritzen um Luftblasen in den Vordergrund zu bringen. Sobald Luft aus dem Spritzen gelöscht wurden, legen Sie die Spritzenpumpe horizontal und schrittweise Tippen Sie oder Schalter Apparat zu entfernen und säubern Luftblasen durchblättern Sie die Polymer-Linien von den Spritzen bis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Bank von Spritzen (wenn Medien wechseln).</li>
	<li>Nach Luftblasen gelöscht werden, setzen die Phase-2-Spritzenpumpe (d. h.mit dem Medium, der verwendet wird zweite, nach dem Wechsel) zu 1,5 µL/min, dann pause den Fluss. Platzieren Sie kleine Binder Clips auf die Segmente der Schlauch auf dem Zweig der Y-Kreuzungen, die zweite, mittlere Phase entspricht. Weiterhin ausgeführt, die Phase-1 Spritzenpumpe mit einer bescheidenen Durchflussrate (z.B. 10 µL/min) für mindestens 30 min, das zweite Medium aus den Zulauf-Schlauch säubern stromabwärts von der Y-Kreuzung.</li>
</ol>(4) Zelle Kultur Vorbereitung
<ol><li>Wachsen Sie eine Vorkultur der Belastung der Interesse an dem gewünschten Medium auf stationäre Phase über Nacht. Der Bakterienstamm sollte eine Mutation enthalten, die macht die Zellen unbeweglich, so dass die Zellen aus der Kanäle des Gerätes nicht schwimmen zu tun. Hinweis: In diesem Protokoll wird der Bakterienstamm B. Subtilis 3610 mit einem HagA233V Substitution (diese Mutation bewirkt, dass die Geissel direkt anstatt spiralförmige, Vermeidung von Zelle Motilität zu sein), eine PRsbV- mNeonGreen Reporter für Zelle Stress und eine konstitutive PHyperspank- mNeptune (rot) Reporter Zellen zu markieren. LB-Lennox-Medium wird im Beispiel Protokoll verwendet. Typische Belastungen für Mikrofluidik Experimente enthalten eine oder mehrere fluoreszierende transkriptionelle Reporter und ein konstitutiv produziert, zytoplasmatischen fluoreszierende Protein um automatisierte Erkennung von Zellen zu erleichtern. Wachstumsstörungen wurden nicht beobachtet, wenn LB Lennox reichen Medium verwendet wurde, aber B. Subtilis Wachstum bei minimaler Medien unter mikrofluidischen Bedingungen gehemmt kann, weil abgesondert, dass Siderophores durch die mittlere Strömung weggespült werden. Unter solchen Umständen kann Wachstum durch die Zugabe von Natriumcitrat und Eisenchlorid auf das Medium wiederhergestellt werden, wie für S750 mittlere11berichtet.</li>
	<li>Verdünnen Sie am Morgen des Experiments, B. Subtilis Zellen 01:50 in eine verblüfft 250-mL-Flasche mit 25 mL Wachstumsmedium. Wachsen Sie die Zellen für 5-6 h in Kultur bei 37 ° C zu einer optischen Dichte von mehr als 1 schütteln. Hinweis: Eine Dichte Zellkultur ist vorzuziehen, da die stationäre Phase B. Subtilis sind kleiner und weniger häufig gefunden in Zelle Zellen Ketten, Gerät laden zu erleichtern. Verschiedene Bakterienarten erfordern andere Mittel "oder" Wachstum Bedingungen für optimale Beladung.</li>
	<li>Mit einer Spritze, ausgestattet mit einem 5 µm Porengröße Filter, Filtern Sie etwa 15 mL der Zellkultur in ein 15 mL konische Röhrchen, B. Subtilis Zelle Ketten zu entfernen (es ist nicht erforderlich für E. Coli und kann nicht mit anderen Arten erforderlich sein). Hinweis: Es sollte relativ wenige Zellen entfernt werden; das Filtrat sollten trübe werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gefilterten Kultur für 10 min bei 4.000 x g bei Raumtemperatur. Der Überstand abgießen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in die Restflüssigkeit überstand noch in die Röhre, ca. 500 µL frisches Medium hinzufügen, wenn erforderlich, um die Zellsuspension pipettieren.</li>
</ol>5. Gerät laden
<ol><li>Legen Sie vorsichtig leeren dünnen Gel-Loading Mikropipette Tipps (siehe Tabelle der Materialien) in die Steckdose Löcher von mikrofluidischen Gerät.</li>
	<li>Mit dünnen Gel-laden-Tipps mit einer Mikropipette P200, passiviert das Gerät durch die Injektion von 1 mg/mL BSA in den Saugbohrungen beobachten die Tipps in die Steckdose Löcher zur Füllung der mikrofluidische Kanäle (Abbildung 2A) Überwachung-haltigem Medium. Inkubieren Sie das Gerät für ca. 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: BSA dient häufig als blockiert oder Passivierung Agent, der an der hydrophoben Oberfläche des Polymers PDMS binden wird erhöhen die Hydrophilie und die Bindung von anderen Proteinen oder von Zellen (über Zelle Oberfläche Moleküle) zu reduzieren.</li>
	<li>Mit dünnen Gel-Loading Tipps laden Sie jeden Kanal mit der resuspendierte Zellen (aus Abschnitt 4), mit den Tipps in den Auslasskanal zur Überwachung des Fortschritts der Zellen durch das Gerät (Abb. 2 b). Hinweis: Laden wird durch Festlegen der P200 Mikropipette auf maximal 200 µL Volumen und dann absaugen ein Luftpolster vor dem Absaugen eines kleinen Volumens (ungefähr Hälfte des Volumens der Dünnschliff die Pipettenspitze) Zellen erleichtert. Das Volumen der resuspendierte Zellen muss nicht genau, wie die Lautstärke des Gerätes PDMS klein im Verhältnis zu derjenigen der Mikropipette ist. Wir kennen keine Obergrenze für die Dichte der resuspendierte Zellen, solange die Zellsuspension in das Gerät pipettiert werden kann. Zelle Klumpen können das Gerät verstopfen und sollten vermieden werden, durch gründliche pipettieren und/oder Vortex mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Gel-laden-Tipps aus der Steckdose Löcher, arbeiten jeweils einzeln zu Schäden am Gerät zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Gerät in einem Tischgerät Microcentrifuge in einen entsprechenden Rotor-Adapter bei ca. 6.000 x g für 10 min (Abbildung 2). Hinweis: Ein benutzerdefinierte bearbeitet Aluminium Rotor-Adapter, der entworfen wurde, um in einem Microcentrifuge Rotor (Abbildung 2) passen diente; verschiedenen Zentrifuge Modelle können mit entsprechenden Rotor-Adapter verwendet werden. Die wichtige Funktion des Adapters ist, dass es seitliche Kraft in Richtung der geschlossenen Enden der Zelle Schützengräben, so zwingt Zellen in die seitlichen Kanäle bietet.</li>
	<li>Erfolgreiche laden unter dem Mikroskop (Abbildung 3) zu überprüfen, aber ohne Anbringung des Geräts auf die Folie Halter/Bühne einfügen. Hinweis: In diesem Protokoll, eine 60 X 1,4 NA Ph3 Ölimmersion Ziel für beide Prüfung zu diesem Zeitpunkt und für die nachfolgende Bildgebung dient.</li>
</ol>6. die Gerätemontage, Gleichgewichtherstellung und Montage
<ol><li>Sorgfältig montieren Sie das geladene Gerät auf einer Bühne Einlage durch Abkleben das Deckglas auf beiden Seiten des PDMS am unteren Rand der Bühne einfügen (d.h., invertieren die Bühne legen Sie vor dem Anbringen des Gerätes). Drehen Sie die Bühne einfügen-Gerätemontage, so dass die PDMS nach oben und legen Sie auf einer weichen Unterlage, wie z. B. einem staubfreien Tuch (Abb. 2D).</li>
	<li>Einstellen die Durchflussmenge des Phase-1-Spritzenpumpe auf 35 µL/min arbeiten mit einem Fahrstreifen in einer Zeit, legen Sie die Einlassnadel und dann die Steckdose Nadel (d.h., läuft auf den Abfall Becher; Abb. 2E).</li>
	<li>Jedes überschüssige Medium mit einer sauberen, staubfreien Tuch abwischen und das Gerät auf Dichtheit überprüfen. Prüfen Sie den Steckdose Schlauch für das Erscheinungsbild der überschüssigen Zellen (in der Regel erscheint als eine trübe Streifen) und die mittlere Meniskus, die langsam in Richtung der Abfälle Becher bewegen wird.</li>
	<li>Das Gerät bei 35 µL/min für ca. 15-30 min laufen lassen, bis alle angeschlossenen Bahnen in den Abfall Becherglas Entwässerung sind zu ermöglichen.</li>
	<li>Die Phase-1 Spritzenpumpe auf 1,5 µL/min und unterbrechen Sie den Informationsfluss. Bringen Sie den gesamten Apparat der Pumpe und Gerät an das Mikroskop (dieser Prozess wird unterstützt, indem sie alles auf einem rollenden Wagen) und starten Sie die Phase-1 mittlerer Durchfluss 1,5 µL/min. sorgfältig montieren die Bühne einfügen mit dem Gerät auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Band wie nötig, um den Einlass und Auslass-Schlauch zu verlegen.</li>
	<li>Suchen Sie die gewünschte Positionen auf dem Gerät für die Bildgebung und beginnen Sie Bildgebung wie gewünscht zu. Beachten Sie, dass Zellen in der Regel ein paar Stunden (ca. 10 Generationen benötigen), stationäre exponentielle Phase Wachstum zu erreichen, und der Beginn der Bildaufnahme werden, wie verzögert kann gewünscht, so dass Bildgebung nach Gleichgewichtherstellung Periode beginnt. Hinweis: Das stationäre Wachstum von Zellen in der exponentiellen Phase statt sollte überprüft werden während der nachfolgenden Bildanalyse durch Zellteilung Zeiten zu verfolgen und sicherzustellen, dass sie einen konstante Mindestwert erreicht haben.</li>
</ol>7. mittlerer wechseln
<ol><li>Zwischen den aufeinander folgenden Runden der Bildgebung halten Sie an, den Fluss von Phase-1-Spritzenpumpe. Vorsichtig ausclipsen der Bindemittel-Clips aus der Phase-2-Silikon Schläuche, verschieben jeweils den Silikonschlauch auf dem Phase-1-Zweig der Y-Kreuzung. UN-Pause den Fluss des Phase-2 Spritze Pumpe (die auf 1,5 µL/min im Schritt 3.8 gesetzt wurde) und Bildgebung weiter. Hinweis: bei 1,5 µm/min mit einer 10-cm-Länge von Polymer tubing flussabwärts der Y-Kreuzungen der zweiten Phase Medium erreicht das Gerät in etwa 50 Minuten. Die Zeit, um das Gerät kann mit Medien, die Fluoreszenz Tracer Partikel enthalten empirisch getestet werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Mikrofluidik-Protokoll ist flexibel, dass viele der Schritte zur Optimierung ihrer Nutzung mit einer bestimmten Art oder Sorte oder für einen bestimmten Zweck geändert werden können. In diesem Protokoll haben wir Änderungen an der ursprünglichen "Mutter-Maschine" Konzept4 zur Optimierung ihrer Nutzung mit B. Subtilisgemacht. Oft bilden die Schützengräben, in denen die Zellen beschränkt sind, eine einschichtige Funktion während in dieses Protokoll verwenden wir Zweischicht-Z...

Eines der auffälligsten Merkmale des Lebens auf der Erde ist seine große Widerstandsfähigkeit und Vielfalt. Ein zentrales Ziel der Molekularbiologie ist es, die Logik zu verstehen, mit der Zellen Gene und Proteine verwenden, um ihr Wachstum und ihre Fitness unter verschiedensten Umweltbedingungen zu maximieren. Um dieses Ziel zu erreichen, Wissenschaftler dürfen getrost zu beobachten wie einzelne Zellen wachsen, teilen und express ihre Gene unter einem gegebenen Satz von Bedingungen, unter Hinweis darauf, wie Zellen auf nachträgliche Änderungen in ihrer Umgebung reagieren. Traditionellen analytische Methoden in der Mikrobiologie haben jedoch technische Einschränkungen, die die Arten von Fragen betreffen, die behandelt werden können. Zum Beispiel Bulk Kultur-basierte Analysen haben im Laufe der Jahre als sehr nützlich erwiesen, aber sie bieten nur Populationsebene Daten, die sinnvolle Zell-Zell-Varianten oder das Verhalten der kleinere Sub-Populationen von Zellen an der Gesamtbevölkerung überdecken können. Einzellige Analysen von lebenden Bakterien basierend auf Lichtmikroskopie einzellige Verhalten offenbaren aber auch technisch beschränkt. Bakterien sind in der Regel auf Agarose-Pads mit Wachstumsmedium, immobilisiert aber Zelle Wachstum und Teilung Massen die mikroskopische Ansicht und die verfügbaren Nährstoffe verbraucht, nach nur wenigen Zelle Zyklen deutlich begrenzen die Beobachtung Zeit1, 2. Darüber hinaus verändern die lokalen Erschöpfung der Nährstoffe und der gleichzeitige Aufbau von Stoffwechselprodukte durch Zellwachstum ständig die lokalen Zelle Wachstum Umwelt in einer Weise, die schwierig zu messen oder vorherzusagen. Solche Veränderungen der Umwelt mit Agarose-Pads stellen eine Herausforderung für Studien von stationären Verhaltensweisen oder der zellulären Reaktionen auf spezifische Veränderungen im Wachstum Bedingungen3.
Mikrofluidische Technologie, in denen ein flüssiges Medium Microfabricated Geräte ständig durchströmt wird bietet eine Lösung für klassische experimentelle Einschränkungen. Ein mikrofluidischen Gerät kann Einzelzellen für Leben-Zelle Mikroskopie in Position halten, während den Fluss der Wachstumsmedium ständig versorgt die Zellen mit frischen Nährstoffe und Stoffwechselprodukte und überschüssigen Zellen, wodurch eine sehr gleichmäßig wächst wäscht Umgebung. Unter konstanten Wachstumsbedingungen können losgelöst von der Einfluss von Umweltfaktoren, erlaubt einen ungehinderten Blick auf die innere Logik der Zellen Zelle Verhalten beobachtet werden. Da die Strömung mikrofluidischen Gerät verhindert, immer voll mit Zellen, wird Beobachtung der einzelnen Zelle Linien für Dutzende oder Hunderte von Generationen möglich4,5. So lange Beobachtungszeiten ermöglichen die Erkennung von sonst nicht nachweisbar langfristige oder seltenen Zelle Verhalten. Schließlich wird die Zusammensetzung des Mediums, die durch das Gerät fließt bei geändert werden können, Zellen zu beachten, da sie zu Beginn einer Belastung oder die Einführung oder die Entfernung einer bestimmten Substanz reagieren.
Mikrofluidik hat bereits eine Reihe von wichtigen Anwendungen genossen. Zum Beispiel wurde es verwendet in Gewebe, Organ oder Körper-on-a-Chip-Geräte, in denen mehrere menschliche Zelltypen Co kultiviert, eine in Vivo Zustand6zu simulieren sind. für die Studie der Nematoden Bewegung in mikrostrukturierten Umgebungen7; untersuchen Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Biofilmen (z.B. 8); und für die Kapselung und Manipulation von winzigen Mengen von Zellen oder Chemikalien (z.B. 9). Mikrofluidische Geräte auch auf dem Gebiet der Mikrobiologie (für sehr gute Kritiken, s. 10 und 11), zumal ihre körperliche zunehmend populär geworden und Fließeigenschaften sind gut aufeinander abgestimmt, um natürliche mikrobielle Nischen12. Zum Beispiel wurde Mikrofluidik vor kurzem von Mikrobiologen für solche Zwecke eingesetzt als Zelle Wachstum und Teilung13,14,15, Analyse der Erreger Bewegung16genau zu messen, Quorum sensing17 und physiologischen Übergänge18überwachen und für Protein zählen19, unter vielen anderen Beispielen. Die hier vorgestellte Methode ist speziell für die Analyse der einzelnen Bakterienzelle Linien anstatt Kombinationen von Sorten oder Arten. Das mikrofluidischen Gerät demonstriert hier nutzt eine Variante der "Mutter-Maschine" Design4, in dem Zellen Einzeldatei wachsen-innerhalb einer mikrofluidischen Graben mit einem geschlossenen und einem offenen Ende; Zelle Wachstum und Teilung schiebt Nachkommen Zellen oben und aus dem offenen Ende in die Strömung. Unsere Analysen konzentrieren sich in der Regel nur auf die "" Mutterzelle, die geschlossene Ende des Grabens beschränkt ist. Wir betrachten diese Methode als ein Fortschritt gegenüber früheren Licht Mikroskopie-basierte einzellige analytische Techniken, wie z. B. Zelle Immobilisierung auf Agarose-Pads. Während B. Subtilis als Vorbild dient, die Methode gilt auch für andere Bakterienarten (Escherichia coli ist ein weiteres gemeinsames Modell, einige Arten mit unterschiedlichen Zellgrößen oder Morphologien erfordern die Herstellung neuer Geräte mit verschiedenen Dimensionen). Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter um Zellen zu markieren und zu Veränderungen in der Genexpression zu visualisieren erfordert den Einsatz von genetisch gefügig Arten; Analysen von Zellwachstum und Morphologie sind jedoch auch ohne fluoreszierende Markierungen möglich.
Dieses Protokoll schließt den Prozess der Herstellung des Silizium-Meisters mittels Fotolithografie, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde5; Meister können auch leicht vom Microfabrication Einrichtungen ausgelagert werden. Freuen Sie sich auf die Ausformung eines PDMS-Geräts von einem verstärkten Silizium-Meister; kleben das Gerät an ein Deckglas; Montage der mikrofluidischen Einlass und Auslass Sanitär, Armaturen einschließlich Prise um mittlere umschalten zu ermöglichen; Passivierungslösung das Gerät, die Vorbereitung von Bakterienzellen und laden das Gerät mit Bakterienzellen; Befestigung der Rohrleitungen an das Gerät und Äquilibrierung der Zellen; und laden das Gerät auf eine Fluoreszenzmikroskop für die Bildgebung. Da viele verschiedene Bildaufnahme und processing-Software, die Werkzeuge verwendet werden können, zu visualisieren und analysieren Sie verschiedene Daten von Interesse4,5, sind Beispielbilder gezeigt, aber Bilderfassung Methoden sind in diesem Protokoll nicht enthalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">(240)4019862</td>
			<td style="width:167px;">This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">0.75-mm biopsy punch</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393 172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Plasma Etch PE-50</td>
			<td style="width:71px;">Plasma Etch Inc.</td>
			<td style="width:119px;">PE-50</td>
			<td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Tygon flexible tubing ID 0.02&#34;, OD 0.06&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Saint-Gobain PPL Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:223px;">Silicone Tubing, 0.04&#34; ID, 0.085&#34; OD</td>
			<td style="width:71px;">HelixMark Standard Silicone Tubing</td>
			<td style="width:119px;">60-795-05</td>
			<td>For pinch valves and Y-junction connection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906-100G</td>
			<td>Used as passivation agent</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">ART Gel Pipet Tips (P200)</td>
			<td style="width:71px;">Molecular BioProducts</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2155</td>
			<td>For loading the device with medium and cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&#956;m Supor membrane</td>
			<td style="width:71px;">Pall Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4560</td>
			<td>For filtering cultures before device loading</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">21-ga blunt needles, 1&#34;</td>
			<td style="width:71px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">75165A681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Y connector with 200-series barbs, 1/16&#34; ID tubing, polypropylene</td>
			<td style="width:71px;">Nordson Medical</td>
			<td style="width:119px;">Y210-6005</td>
			<td>The company is AKA Value Plastics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">LB Lennox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Bacillus subtilis strain NCIB3610</td>
			<td style="width:71px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:119px;">3A1</td>
			<td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gravity convection oven</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">414005-106</td>
			<td>for curing PDMS and baking assembled devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch-Weld Epoxy Kit</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">2216 B/A</td>
			<td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Scotch Magic tape, 3/4&#34; width</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &#34;office tape&#34; or &#34;adhesive tape&#34; in protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ800N</td>
			<td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td>To clean cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Syring pump, 6 channel</td>
			<td style="width:71px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td>a brand of dust-free wipes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

Mikrofluidische Technologie überwindet viele der Einschränkungen zu den traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie. Anders als Massen-Kultur bietet es eine einzellige Auflösung und lange Beobachtung Zeiten überspannt Hunderte von Generationen; im Gegensatz zu Agarose Pad-basierte Mikroskopie hat es einheitliche Wachstumsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Weil der kontinuierliche Fluss von Nährmedium der Zellen in einem mikrofluidischen Gerät aus unvorhersehbaren Schwankungen in der chemischen Umgebung verursacht durch Zellwachstum und Stoffwechsel, authentische Veränderungen der Genexpression und das Zellwachstum in Reaktion auf isoliert bestimmte Reize können sicher beobachtet werden. Bacillus Subtilis dient hier als ein Modell Bakterienarten, eine "Mutter-Maschine" zu demonstrieren-Methode für die zelluläre Analyse geben. Wir zeigen, wie Sie zu konstruieren und mikrofluidischen Gerät zu ergründen, mit Zellen zu laden, mikroskopische Bildgebung zu initiieren, und setzen Zellen auf einen Reiz durch den Wechsel von einem Wachstumsmedium zum anderen. Stress-responsive Reporter wird als Beispiel verwendet, um den Typ der Daten offenbaren, die mit dieser Methode erzielt werden können. Wir diskutieren auch kurz weitere Anwendungen dieser Methode für andere Arten von Experimenten, wie z. B. Analyse der bakteriellen Sporenbildung.

Erfolgreiche erste Zelle laden, wie Phasenkontrast-Mikroskopie bewertet vor dem Anbringen der mikrofluidischen Sanitär an das Gerät würde gelten, dass alle oder fast alle der mikrofluidischen Seitenarmen, enthält eine oder mehrere bakterielle Zellen ( Abbildung 3A). Optimale Beladung würde mehrere Zellen in jedem Kanal zeigen, aber Kanäle füllt sich dennoch mit Zellen durch Zellwachstum Gleichgewichtherstellung Zeitraum (Abb. 3 b</...

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Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K Aufrufe.  Oklahoma State University. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Serie: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Forschung

Biologie

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...