Name: single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
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Dieses Projekt wurde gefördert durch die National Institutes of Health unter GM018568. Dieses Protokoll wurde teilweise in der Mitte für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, die von der National Science Foundation unter NSF Award Nr. 1541959 unterstützt wird. CNS ist Teil der Harvard University. Vielen Dank gebührt Thomas Norman und Nathan Herrn für ihre Arbeit bei der Konzeption und Herstellung der Mastervorlage für die Geräte gezeigt, hier und in den Aufbau der ursprünglichen Version des Geräts verwendet. Wir auch vielen Johan Paulsson für seine wertvolle gemeinsame Beratung und vielen Mitglieder von seinem Labor für ihre Ratschläge und weitere Verbesserungen zu bakteriellen mikrofluidischen Apparate.

(1) PDMS Gerät Casting
<ol><li>In einer staubfreien Umgebung PDMS Polymer und Härtemittel im Verhältnis 10:1 mischen und unter Vakuum für mindestens 10 Minuten entgasen.</li>
	<li>Legen Sie ein Silizium-Meister (oder eine Epoxid oder Polyurethan Nachbildung davon) auf ein Stück Alufolie ungebrochen in einem Polystyrol Petri-Platte. Den Teig entgast PDMS über den Master bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm. Degas die Petri-Platte für mindestens 10 Minuten Nutzung eines sanften Luftstrom Oberfläche Bläschen zu brechen. Hinweis: Die Abmessungen des Gerätes zwei Ebenen werden zur Verfügung gestellt im zugehörigen CAD Datei5 (siehe ergänzende Datei 1). Ein plastische Nachbildung Master kann teilweise während der Entgasung schweben; in diesem Fall drücken Sie das Replikat mit eine saubere Kunststoff-Applikator.</li>
	<li>PDMS für mindestens 1 Stunde im Ofen bei 60 ° C zu heilen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Entfernen Sie die Master- und ausgehärteten PDMS aus der Petri-Platte mit Aluminium-Folie. Die Aluminium-Folie von der Rückseite des Meisters ziehen Sie vorsichtig ab, dann ziehen Sie vorsichtig die PDMS vom Master. Hinweis: Alternativ können PDMS über Nacht bei Raumtemperatur geheilt werden. Die relative Zerbrechlichkeit eines Silizium-Wafer-Master kann überwunden werden, indem mit Epoxy Klebstoff dauerhaft binden den Wafer zu einem 1/16-Zoll-dicken Aluminiumscheibe von der gleichen Größe wie der Wafer.</li>
	<li>Ein Wafer in der Regel mehrere mikrofluidischen Geräte mit leicht unterschiedlichen Dimensionen umfasst (siehe ergänzende Datei 1), ein einziges Gerät mit einem sauberen, scharfen Skalpell Größe geschnitten. Hinweis: Für Routine B. Subtilis arbeiten, verwenden Sie Geräte mit 1,0 µm breite Zelle Gräben, die mit einem C oder F in der zugehörigen CAD-Datei markiert sind.</li>
</ol>2. Gerät Stanzen und kleben
<ol><li>Ort ein Stück transluzent Büro mit Klebeband (siehe Tabelle der Materialien) über die gemusterte Seite des Geräts, um die Sichtbarkeit der gemusterten Features zu verbessern. Die Einlass und Auslass Ports werden als Kreisflächen an den entgegengesetzten Enden der sichtbaren fluidische Kanäle (Abbildung 1) identifiziert. Um ihre Sichtbarkeit zu verbessern, beim Stanzen von Löchern in das Gerät für den Einlass und Auslass Pins, markieren Sie die ein- und Ausläufe mit Punkten mit einer feinen Spitze Marker. Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Einlass und Auslass Pins nicht überfüllt sind, wird jeder andere Kanal gelocht beginnend mit den Kanal direkt unter dem alphabetischen Bezeichner für das Gerät.</li>
	<li>Das PDMS-Gerät drehen, so dass die Dekorseite nach unten ist, und durch das Gerät zu den markierten Punkten eine 0,75 mm Biopsie-Punch mit Punsch; entsorgen Sie die Ausstanzungen. Hinweis: Die Geräte sind mit der Dekorseite nach unten schlug, weil das Loch durch die Biopsie-Punch erzeugt in der Regel leicht ausgestellte ist wo der Stempel des Polymers betritt. Stanzen das Gerät in eine umgekehrte Orientierung sorgt dafür, dass das Loch auf die Dekorseite eine scharfe Grenze hat.</li>
	<li>Mit einem Stereomikroskop, sicherzustellen Sie, dass die gestanzten Löcher überschneiden sich mit den Einlass und Auslass des Gerätes. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette, um keine überflüssigen Fragmente von PDMS aus gestanzten Löcher zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie Klebeband, um Staub von beiden Seiten des Geräts und des Ortes in einer sauberen Polystyrol Petri-Platte zu entfernen. Bereiten Sie ein Deckglas 22 x 40 mm, durch Benetzung mit 100 % Isopropyl-Alkohol und rieb mit einem Reinraum abwischen; trocken mit einem Strom von staubfreie Luft oder Stickstoff.</li>
	<li>Stellen Sie die gestanzte PDMS Gerät Funktion Seite nach oben zusammen mit dem gereinigten Deckglas in einem Sauerstoffplasma sauberer.<ol>
<li>Plasma-Behandlung das Gerät mit den folgenden Einstellungen: Vakuum, 70 mTorr; O2 Druck, 200 mTorr; Dauer, 15 s; macht, sofort nach Abschluss die Plasma-Behandlungsdauer 30 W. Gerät und Deckglas aus dem Plasma Reiniger entfernen.</li>
		<li>Invertieren Sie der PDMS und legen Sie es auf das Zentrum der Glasabdeckung, so dass die Dekorseite das Glas berührt; Stellen Sie sicher, dass die Fütterung Kanäle (laufen zwischen den Einlass und Auslass) mit der Längsachse der Glasabdeckung ausgerichtet sind. Drücken Sie sehr sanft, um sicherzustellen, dass die PDMS Dichtungen gegen das Glas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Backen Sie das montierte Gerät in einem Ofen für mindestens 1 h bei 60 ° C. Nach dem Backen, manuell überprüfen Sie, ob die PDMS auf das Glas verklebt wird, indem man vorsichtig an einer Ecke des Geräts. Hinweis: Sobald das Gerät verbunden ist, sollte es innerhalb von 24 h verwendet werden wie das Polymer wird zunehmend hydrophobe mit zunehmender Zeit nach Plasmabehandlung.</li>
</ol>(3) mikrofluidischen Sanitär-Vorbereitung
<ol><li>Schnittlängen Sie Polymer Schläuche (Innendurchmesser (ID) 0,02 Zoll Außendurchmesser (OD) 0,06 Zoll) passenden Längen von der Spritzenpumpe der Vermittlungsvorrichtung zu erreichen, um (falls verwendet) und das Gerät auf das Mikroskop montiert. Schnittlängen Sie so viele mikrofluidischen Gassen gibt.</li>
	<li>Montieren Sie Y Kreuzungen für Quetschventile (falls verwendet) durch Schneiden und Anbringen von 2 cm Länge des flexiblen Silikon Schläuche (0,03 Zoll ID, 0,065 Zoll OD) an der oberen Widerhaken des "Y" und 1 cm Länge der Silikonschlauch auf der unteren Widerhaken des "Y".</li>
	<li>10 cm (oder geeigneten) Schnittlängen von Polymer-Schläuche; verbinden Sie sie mit einem Ende an der Switch-Verzweigung durch Einfügen in die 1 cm Silikon Schlauch Segmente auf der unteren Widerhaken des "Y". Schließen Sie sie an das andere Ende an 21G Nadeln, die von ihren Kunststoffspritze Adapter und gebogen ca. 90 ° etwa 9 mm vom Ende der Nadel entfernt wurden.</li>
	<li>Schließen Sie 21G stumpfe Nadeln an einem Ende der Röhre Segmente, die von den Spritzen auf den Schalter-Apparat ausgeführt wird, indem man die Nadeln in den Schlauch an. Legen Sie die anderen Enden jeder Länge von Schläuche in Silikon Schlauch Segmente auf den Einlass Widerhaken der Y-Kreuzungen. Hinweis: Verwenden Sie irgendeine Art von Apparat, um Quetschventile und Abzweigungen in Position zu halten; Dies kann leicht von einer Mikropipette Tip Box (Abb. 2D) erfolgen.</li>
	<li>Schnittlängen von Polymer-Schläuche, Abfälle aus der Steckdose des Geräts zu einem Abfall-Becher zu tragen. Verbinden Sie sie mit einem Ende an gebogenen 21G Nadeln vorbereitet, wie oben beschrieben. Kleben Sie das andere Ende der Rohre in einem Abfall-Becher.</li>
	<li>Bereiten Sie entsprechende Mengen an Medien mit 0,1 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen Sie die gewünschte Größe und Anzahl der Spritzen. Verbinden Sie die BSA geladen Spritzen an den vorbereiteten 21G Nadeln befestigt, die Einlass Schlauch und Ladung Spritzen in Spritzenpumpen. Hinweis: für typische Experimente, die 5 Kanäle des Gerätes verwendet werden, jeweils mit einer 20-mL-Spritze. Ein Experiment, in dem das Medium gewechselt ist, erfordert 2 Bänke 5 Spritzen. Hier die Pumpe mit der erste Bank nennt man die Phase-1-Pumpe und die Pumpe mit der zweiten Bank, mit dem Post-Schalter-Medium wird als die Phase-2-Pumpe bezeichnet.</li>
	<li>Luft von der Einlass-Sanitär entlüften, durch Ausführen der Spritzenpumpen mit einer high-Flow-Rate (> 500 µL/min), beginnend von der Spritzenpumpen vertikal ausrichten und durch Tippen auf die Spritzen um Luftblasen in den Vordergrund zu bringen. Sobald Luft aus dem Spritzen gelöscht wurden, legen Sie die Spritzenpumpe horizontal und schrittweise Tippen Sie oder Schalter Apparat zu entfernen und säubern Luftblasen durchblättern Sie die Polymer-Linien von den Spritzen bis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Bank von Spritzen (wenn Medien wechseln).</li>
	<li>Nach Luftblasen gelöscht werden, setzen die Phase-2-Spritzenpumpe (d. h.mit dem Medium, der verwendet wird zweite, nach dem Wechsel) zu 1,5 µL/min, dann pause den Fluss. Platzieren Sie kleine Binder Clips auf die Segmente der Schlauch auf dem Zweig der Y-Kreuzungen, die zweite, mittlere Phase entspricht. Weiterhin ausgeführt, die Phase-1 Spritzenpumpe mit einer bescheidenen Durchflussrate (z.B. 10 µL/min) für mindestens 30 min, das zweite Medium aus den Zulauf-Schlauch säubern stromabwärts von der Y-Kreuzung.</li>
</ol>(4) Zelle Kultur Vorbereitung
<ol><li>Wachsen Sie eine Vorkultur der Belastung der Interesse an dem gewünschten Medium auf stationäre Phase über Nacht. Der Bakterienstamm sollte eine Mutation enthalten, die macht die Zellen unbeweglich, so dass die Zellen aus der Kanäle des Gerätes nicht schwimmen zu tun. Hinweis: In diesem Protokoll wird der Bakterienstamm B. Subtilis 3610 mit einem HagA233V Substitution (diese Mutation bewirkt, dass die Geissel direkt anstatt spiralförmige, Vermeidung von Zelle Motilität zu sein), eine PRsbV- mNeonGreen Reporter für Zelle Stress und eine konstitutive PHyperspank- mNeptune (rot) Reporter Zellen zu markieren. LB-Lennox-Medium wird im Beispiel Protokoll verwendet. Typische Belastungen für Mikrofluidik Experimente enthalten eine oder mehrere fluoreszierende transkriptionelle Reporter und ein konstitutiv produziert, zytoplasmatischen fluoreszierende Protein um automatisierte Erkennung von Zellen zu erleichtern. Wachstumsstörungen wurden nicht beobachtet, wenn LB Lennox reichen Medium verwendet wurde, aber B. Subtilis Wachstum bei minimaler Medien unter mikrofluidischen Bedingungen gehemmt kann, weil abgesondert, dass Siderophores durch die mittlere Strömung weggespült werden. Unter solchen Umständen kann Wachstum durch die Zugabe von Natriumcitrat und Eisenchlorid auf das Medium wiederhergestellt werden, wie für S750 mittlere11berichtet.</li>
	<li>Verdünnen Sie am Morgen des Experiments, B. Subtilis Zellen 01:50 in eine verblüfft 250-mL-Flasche mit 25 mL Wachstumsmedium. Wachsen Sie die Zellen für 5-6 h in Kultur bei 37 ° C zu einer optischen Dichte von mehr als 1 schütteln. Hinweis: Eine Dichte Zellkultur ist vorzuziehen, da die stationäre Phase B. Subtilis sind kleiner und weniger häufig gefunden in Zelle Zellen Ketten, Gerät laden zu erleichtern. Verschiedene Bakterienarten erfordern andere Mittel "oder" Wachstum Bedingungen für optimale Beladung.</li>
	<li>Mit einer Spritze, ausgestattet mit einem 5 µm Porengröße Filter, Filtern Sie etwa 15 mL der Zellkultur in ein 15 mL konische Röhrchen, B. Subtilis Zelle Ketten zu entfernen (es ist nicht erforderlich für E. Coli und kann nicht mit anderen Arten erforderlich sein). Hinweis: Es sollte relativ wenige Zellen entfernt werden; das Filtrat sollten trübe werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gefilterten Kultur für 10 min bei 4.000 x g bei Raumtemperatur. Der Überstand abgießen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in die Restflüssigkeit überstand noch in die Röhre, ca. 500 µL frisches Medium hinzufügen, wenn erforderlich, um die Zellsuspension pipettieren.</li>
</ol>5. Gerät laden
<ol><li>Legen Sie vorsichtig leeren dünnen Gel-Loading Mikropipette Tipps (siehe Tabelle der Materialien) in die Steckdose Löcher von mikrofluidischen Gerät.</li>
	<li>Mit dünnen Gel-laden-Tipps mit einer Mikropipette P200, passiviert das Gerät durch die Injektion von 1 mg/mL BSA in den Saugbohrungen beobachten die Tipps in die Steckdose Löcher zur Füllung der mikrofluidische Kanäle (Abbildung 2A) Überwachung-haltigem Medium. Inkubieren Sie das Gerät für ca. 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: BSA dient häufig als blockiert oder Passivierung Agent, der an der hydrophoben Oberfläche des Polymers PDMS binden wird erhöhen die Hydrophilie und die Bindung von anderen Proteinen oder von Zellen (über Zelle Oberfläche Moleküle) zu reduzieren.</li>
	<li>Mit dünnen Gel-Loading Tipps laden Sie jeden Kanal mit der resuspendierte Zellen (aus Abschnitt 4), mit den Tipps in den Auslasskanal zur Überwachung des Fortschritts der Zellen durch das Gerät (Abb. 2 b). Hinweis: Laden wird durch Festlegen der P200 Mikropipette auf maximal 200 µL Volumen und dann absaugen ein Luftpolster vor dem Absaugen eines kleinen Volumens (ungefähr Hälfte des Volumens der Dünnschliff die Pipettenspitze) Zellen erleichtert. Das Volumen der resuspendierte Zellen muss nicht genau, wie die Lautstärke des Gerätes PDMS klein im Verhältnis zu derjenigen der Mikropipette ist. Wir kennen keine Obergrenze für die Dichte der resuspendierte Zellen, solange die Zellsuspension in das Gerät pipettiert werden kann. Zelle Klumpen können das Gerät verstopfen und sollten vermieden werden, durch gründliche pipettieren und/oder Vortex mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Gel-laden-Tipps aus der Steckdose Löcher, arbeiten jeweils einzeln zu Schäden am Gerät zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Gerät in einem Tischgerät Microcentrifuge in einen entsprechenden Rotor-Adapter bei ca. 6.000 x g für 10 min (Abbildung 2). Hinweis: Ein benutzerdefinierte bearbeitet Aluminium Rotor-Adapter, der entworfen wurde, um in einem Microcentrifuge Rotor (Abbildung 2) passen diente; verschiedenen Zentrifuge Modelle können mit entsprechenden Rotor-Adapter verwendet werden. Die wichtige Funktion des Adapters ist, dass es seitliche Kraft in Richtung der geschlossenen Enden der Zelle Schützengräben, so zwingt Zellen in die seitlichen Kanäle bietet.</li>
	<li>Erfolgreiche laden unter dem Mikroskop (Abbildung 3) zu überprüfen, aber ohne Anbringung des Geräts auf die Folie Halter/Bühne einfügen. Hinweis: In diesem Protokoll, eine 60 X 1,4 NA Ph3 Ölimmersion Ziel für beide Prüfung zu diesem Zeitpunkt und für die nachfolgende Bildgebung dient.</li>
</ol>6. die Gerätemontage, Gleichgewichtherstellung und Montage
<ol><li>Sorgfältig montieren Sie das geladene Gerät auf einer Bühne Einlage durch Abkleben das Deckglas auf beiden Seiten des PDMS am unteren Rand der Bühne einfügen (d.h., invertieren die Bühne legen Sie vor dem Anbringen des Gerätes). Drehen Sie die Bühne einfügen-Gerätemontage, so dass die PDMS nach oben und legen Sie auf einer weichen Unterlage, wie z. B. einem staubfreien Tuch (Abb. 2D).</li>
	<li>Einstellen die Durchflussmenge des Phase-1-Spritzenpumpe auf 35 µL/min arbeiten mit einem Fahrstreifen in einer Zeit, legen Sie die Einlassnadel und dann die Steckdose Nadel (d.h., läuft auf den Abfall Becher; Abb. 2E).</li>
	<li>Jedes überschüssige Medium mit einer sauberen, staubfreien Tuch abwischen und das Gerät auf Dichtheit überprüfen. Prüfen Sie den Steckdose Schlauch für das Erscheinungsbild der überschüssigen Zellen (in der Regel erscheint als eine trübe Streifen) und die mittlere Meniskus, die langsam in Richtung der Abfälle Becher bewegen wird.</li>
	<li>Das Gerät bei 35 µL/min für ca. 15-30 min laufen lassen, bis alle angeschlossenen Bahnen in den Abfall Becherglas Entwässerung sind zu ermöglichen.</li>
	<li>Die Phase-1 Spritzenpumpe auf 1,5 µL/min und unterbrechen Sie den Informationsfluss. Bringen Sie den gesamten Apparat der Pumpe und Gerät an das Mikroskop (dieser Prozess wird unterstützt, indem sie alles auf einem rollenden Wagen) und starten Sie die Phase-1 mittlerer Durchfluss 1,5 µL/min. sorgfältig montieren die Bühne einfügen mit dem Gerät auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Band wie nötig, um den Einlass und Auslass-Schlauch zu verlegen.</li>
	<li>Suchen Sie die gewünschte Positionen auf dem Gerät für die Bildgebung und beginnen Sie Bildgebung wie gewünscht zu. Beachten Sie, dass Zellen in der Regel ein paar Stunden (ca. 10 Generationen benötigen), stationäre exponentielle Phase Wachstum zu erreichen, und der Beginn der Bildaufnahme werden, wie verzögert kann gewünscht, so dass Bildgebung nach Gleichgewichtherstellung Periode beginnt. Hinweis: Das stationäre Wachstum von Zellen in der exponentiellen Phase statt sollte überprüft werden während der nachfolgenden Bildanalyse durch Zellteilung Zeiten zu verfolgen und sicherzustellen, dass sie einen konstante Mindestwert erreicht haben.</li>
</ol>7. mittlerer wechseln
<ol><li>Zwischen den aufeinander folgenden Runden der Bildgebung halten Sie an, den Fluss von Phase-1-Spritzenpumpe. Vorsichtig ausclipsen der Bindemittel-Clips aus der Phase-2-Silikon Schläuche, verschieben jeweils den Silikonschlauch auf dem Phase-1-Zweig der Y-Kreuzung. UN-Pause den Fluss des Phase-2 Spritze Pumpe (die auf 1,5 µL/min im Schritt 3.8 gesetzt wurde) und Bildgebung weiter. Hinweis: bei 1,5 µm/min mit einer 10-cm-Länge von Polymer tubing flussabwärts der Y-Kreuzungen der zweiten Phase Medium erreicht das Gerät in etwa 50 Minuten. Die Zeit, um das Gerät kann mit Medien, die Fluoreszenz Tracer Partikel enthalten empirisch getestet werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Mikrofluidik-Protokoll ist flexibel, dass viele der Schritte zur Optimierung ihrer Nutzung mit einer bestimmten Art oder Sorte oder für einen bestimmten Zweck geändert werden können. In diesem Protokoll haben wir Änderungen an der ursprünglichen "Mutter-Maschine" Konzept4 zur Optimierung ihrer Nutzung mit B. Subtilisgemacht. Oft bilden die Schützengräben, in denen die Zellen beschränkt sind, eine einschichtige Funktion während in dieses Protokoll verwenden wir Zweischicht-Z...

Eines der auffälligsten Merkmale des Lebens auf der Erde ist seine große Widerstandsfähigkeit und Vielfalt. Ein zentrales Ziel der Molekularbiologie ist es, die Logik zu verstehen, mit der Zellen Gene und Proteine verwenden, um ihr Wachstum und ihre Fitness unter verschiedensten Umweltbedingungen zu maximieren. Um dieses Ziel zu erreichen, Wissenschaftler dürfen getrost zu beobachten wie einzelne Zellen wachsen, teilen und express ihre Gene unter einem gegebenen Satz von Bedingungen, unter Hinweis darauf, wie Zellen auf nachträgliche Änderungen in ihrer Umgebung reagieren. Traditionellen analytische Methoden in der Mikrobiologie haben jedoch technische Einschränkungen, die die Arten von Fragen betreffen, die behandelt werden können. Zum Beispiel Bulk Kultur-basierte Analysen haben im Laufe der Jahre als sehr nützlich erwiesen, aber sie bieten nur Populationsebene Daten, die sinnvolle Zell-Zell-Varianten oder das Verhalten der kleinere Sub-Populationen von Zellen an der Gesamtbevölkerung überdecken können. Einzellige Analysen von lebenden Bakterien basierend auf Lichtmikroskopie einzellige Verhalten offenbaren aber auch technisch beschränkt. Bakterien sind in der Regel auf Agarose-Pads mit Wachstumsmedium, immobilisiert aber Zelle Wachstum und Teilung Massen die mikroskopische Ansicht und die verfügbaren Nährstoffe verbraucht, nach nur wenigen Zelle Zyklen deutlich begrenzen die Beobachtung Zeit1, 2. Darüber hinaus verändern die lokalen Erschöpfung der Nährstoffe und der gleichzeitige Aufbau von Stoffwechselprodukte durch Zellwachstum ständig die lokalen Zelle Wachstum Umwelt in einer Weise, die schwierig zu messen oder vorherzusagen. Solche Veränderungen der Umwelt mit Agarose-Pads stellen eine Herausforderung für Studien von stationären Verhaltensweisen oder der zellulären Reaktionen auf spezifische Veränderungen im Wachstum Bedingungen3.
Mikrofluidische Technologie, in denen ein flüssiges Medium Microfabricated Geräte ständig durchströmt wird bietet eine Lösung für klassische experimentelle Einschränkungen. Ein mikrofluidischen Gerät kann Einzelzellen für Leben-Zelle Mikroskopie in Position halten, während den Fluss der Wachstumsmedium ständig versorgt die Zellen mit frischen Nährstoffe und Stoffwechselprodukte und überschüssigen Zellen, wodurch eine sehr gleichmäßig wächst wäscht Umgebung. Unter konstanten Wachstumsbedingungen können losgelöst von der Einfluss von Umweltfaktoren, erlaubt einen ungehinderten Blick auf die innere Logik der Zellen Zelle Verhalten beobachtet werden. Da die Strömung mikrofluidischen Gerät verhindert, immer voll mit Zellen, wird Beobachtung der einzelnen Zelle Linien für Dutzende oder Hunderte von Generationen möglich4,5. So lange Beobachtungszeiten ermöglichen die Erkennung von sonst nicht nachweisbar langfristige oder seltenen Zelle Verhalten. Schließlich wird die Zusammensetzung des Mediums, die durch das Gerät fließt bei geändert werden können, Zellen zu beachten, da sie zu Beginn einer Belastung oder die Einführung oder die Entfernung einer bestimmten Substanz reagieren.
Mikrofluidik hat bereits eine Reihe von wichtigen Anwendungen genossen. Zum Beispiel wurde es verwendet in Gewebe, Organ oder Körper-on-a-Chip-Geräte, in denen mehrere menschliche Zelltypen Co kultiviert, eine in Vivo Zustand6zu simulieren sind. für die Studie der Nematoden Bewegung in mikrostrukturierten Umgebungen7; untersuchen Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Biofilmen (z.B. 8); und für die Kapselung und Manipulation von winzigen Mengen von Zellen oder Chemikalien (z.B. 9). Mikrofluidische Geräte auch auf dem Gebiet der Mikrobiologie (für sehr gute Kritiken, s. 10 und 11), zumal ihre körperliche zunehmend populär geworden und Fließeigenschaften sind gut aufeinander abgestimmt, um natürliche mikrobielle Nischen12. Zum Beispiel wurde Mikrofluidik vor kurzem von Mikrobiologen für solche Zwecke eingesetzt als Zelle Wachstum und Teilung13,14,15, Analyse der Erreger Bewegung16genau zu messen, Quorum sensing17 und physiologischen Übergänge18überwachen und für Protein zählen19, unter vielen anderen Beispielen. Die hier vorgestellte Methode ist speziell für die Analyse der einzelnen Bakterienzelle Linien anstatt Kombinationen von Sorten oder Arten. Das mikrofluidischen Gerät demonstriert hier nutzt eine Variante der "Mutter-Maschine" Design4, in dem Zellen Einzeldatei wachsen-innerhalb einer mikrofluidischen Graben mit einem geschlossenen und einem offenen Ende; Zelle Wachstum und Teilung schiebt Nachkommen Zellen oben und aus dem offenen Ende in die Strömung. Unsere Analysen konzentrieren sich in der Regel nur auf die "" Mutterzelle, die geschlossene Ende des Grabens beschränkt ist. Wir betrachten diese Methode als ein Fortschritt gegenüber früheren Licht Mikroskopie-basierte einzellige analytische Techniken, wie z. B. Zelle Immobilisierung auf Agarose-Pads. Während B. Subtilis als Vorbild dient, die Methode gilt auch für andere Bakterienarten (Escherichia coli ist ein weiteres gemeinsames Modell, einige Arten mit unterschiedlichen Zellgrößen oder Morphologien erfordern die Herstellung neuer Geräte mit verschiedenen Dimensionen). Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter um Zellen zu markieren und zu Veränderungen in der Genexpression zu visualisieren erfordert den Einsatz von genetisch gefügig Arten; Analysen von Zellwachstum und Morphologie sind jedoch auch ohne fluoreszierende Markierungen möglich.
Dieses Protokoll schließt den Prozess der Herstellung des Silizium-Meisters mittels Fotolithografie, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde5; Meister können auch leicht vom Microfabrication Einrichtungen ausgelagert werden. Freuen Sie sich auf die Ausformung eines PDMS-Geräts von einem verstärkten Silizium-Meister; kleben das Gerät an ein Deckglas; Montage der mikrofluidischen Einlass und Auslass Sanitär, Armaturen einschließlich Prise um mittlere umschalten zu ermöglichen; Passivierungslösung das Gerät, die Vorbereitung von Bakterienzellen und laden das Gerät mit Bakterienzellen; Befestigung der Rohrleitungen an das Gerät und Äquilibrierung der Zellen; und laden das Gerät auf eine Fluoreszenzmikroskop für die Bildgebung. Da viele verschiedene Bildaufnahme und processing-Software, die Werkzeuge verwendet werden können, zu visualisieren und analysieren Sie verschiedene Daten von Interesse4,5, sind Beispielbilder gezeigt, aber Bilderfassung Methoden sind in diesem Protokoll nicht enthalten.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td></tr><tr><td>0.75-mm biopsy punch</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td></tr><tr><td>Tygon flexible tubing ID 0.02&quot;, OD 0.06&quot;</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td></tr><tr><td>Silicone Tubing, 0.04&quot; ID, 0.085&quot; OD</td><td>HelixMark Standard Silicone Tubing</td><td>60-795-05</td><td>For pinch valves and Y-junction connection</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Used as passivation agent</td></tr><tr><td>ART Gel Pipet Tips (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>For loading the device with medium and cells</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&amp;mu;m Supor membrane</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>For filtering cultures before device loading</td></tr><tr><td>21-ga blunt needles, 1&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y connector with 200-series barbs, 1/16&quot; ID tubing, polypropylene</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>The company is AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; strain NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td></tr><tr><td>Gravity convection oven</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>for curing PDMS and baking assembled devices</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td></tr><tr><td>Scotch Magic tape, 3/4&quot; width</td><td>3M</td><td></td><td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &quot;office tape&quot; or &quot;adhesive tape&quot; in protocol)</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>To clean cover glass</td></tr><tr><td>Syring pump, 6 channel</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>a brand of dust-free wipes</td></tr></tbody></table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

Mikrofluidische Technologie überwindet viele der Einschränkungen zu den traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie. Anders als Massen-Kultur bietet es eine einzellige Auflösung und lange Beobachtung Zeiten überspannt Hunderte von Generationen; im Gegensatz zu Agarose Pad-basierte Mikroskopie hat es einheitliche Wachstumsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Weil der kontinuierliche Fluss von Nährmedium der Zellen in einem mikrofluidischen Gerät aus unvorhersehbaren Schwankungen in der chemischen Umgebung verursacht durch Zellwachstum und Stoffwechsel, authentische Veränderungen der Genexpression und das Zellwachstum in Reaktion auf isoliert bestimmte Reize können sicher beobachtet werden. Bacillus Subtilis dient hier als ein Modell Bakterienarten, eine "Mutter-Maschine" zu demonstrieren-Methode für die zelluläre Analyse geben. Wir zeigen, wie Sie zu konstruieren und mikrofluidischen Gerät zu ergründen, mit Zellen zu laden, mikroskopische Bildgebung zu initiieren, und setzen Zellen auf einen Reiz durch den Wechsel von einem Wachstumsmedium zum anderen. Stress-responsive Reporter wird als Beispiel verwendet, um den Typ der Daten offenbaren, die mit dieser Methode erzielt werden können. Wir diskutieren auch kurz weitere Anwendungen dieser Methode für andere Arten von Experimenten, wie z. B. Analyse der bakteriellen Sporenbildung.

Erfolgreiche erste Zelle laden, wie Phasenkontrast-Mikroskopie bewertet vor dem Anbringen der mikrofluidischen Sanitär an das Gerät würde gelten, dass alle oder fast alle der mikrofluidischen Seitenarmen, enthält eine oder mehrere bakterielle Zellen ( Abbildung 3A). Optimale Beladung würde mehrere Zellen in jedem Kanal zeigen, aber Kanäle füllt sich dennoch mit Zellen durch Zellwachstum Gleichgewichtherstellung Zeitraum (Abb. 3 b</...

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Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K Aufrufe.  Oklahoma State University. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Serie: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Biotechnik

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Umwelt

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Biologie

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Verbesserung der Bacillus subtilis-Sporenzählung und Markierungsanalyse in der Durchflusszytometrie

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochemie

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...