Hier stellen wir ein robustes Protokoll zum Nachweis von Bakterien im biopsied Blasengewebe vor, das breite Anwendungen für viele Gewebetypen hat, bei denen Bakterien vermutet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie unvoreingenommen ist. Es ermöglicht dem Forscher, Bakterien im Gewebe zu erkennen, ohne vorher zu wissen, welche Bakterienarten vorhanden sind.
Diese Technik kann helfen, festzustellen, ob Bakterien in die Blasenwände von Frauen mit wiederkehrenden Harnwegsinfektionen eingedrungen sind und therapeutische Entscheidungen wie die Auswahl von gewebedurchdringenden Antibiotika informieren. Während für Blasengewebe entwickelt, kann diese Technik breit auf andere Gewebe mit einem ansässigen Bakterienpopulationen mit minimaler Optimierung angewendet werden. Personen, die neu in dieser Technik sind, können mit Coverslip-Platzierung und Bildgebung zu kämpfen.
Konzentrieren Sie sich auf die Optimierung der Coverslip-Platzierung, um Blasen zu reduzieren und die Bildgebung auf nicht wertvollen Proben zu praktizieren. Helfen, dieses Verfahren zu demonstrieren wird Jashkaran Gadhvi, ein Student in meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie eine leere Dunstabzugshaube oder einen entsprechend ausgestatteten Biosicherheitsschrank mit 70% Ethanol.
Bereiten Sie alle erforderlichen Puffer und Reagenzien vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes fünf Coplin-Gläser mit 70% Ethanol reinigen und die Gläser trocknen lassen. Wenn die Gläser trocken sind, beschriften Sie sie wie hier gezeigt und füllen Sie sie mit 100 Millilitern der entsprechenden Lösung.
Legen Sie in der Dunstabzugshaube zwei Dias pro Biopsie in ein vertikales Diagestell. Legen Sie das vertikale Schiebegestell 10 Minuten lang in das Xylenes 1 Coplin Glas. Danach entfernen Sie das Schiebegestell aus dem Glas und bauchen Sie den Boden auf ein Papiertuch, um überschüssige Xylole zu entfernen.
Legen Sie das Rack für 10 Minuten in das Xylenes 2 Glas. Und dann rehydrieren Sie die de-paraffinierten Gewebeabschnitte in aufeinanderfolgenden Ethanol-Waschungen für jeweils 10 Minuten. Wenn die Waschungen abgeschlossen sind, btaten Sie den Boden des Schiebegestells auf Papiertücher, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und legen Sie das Rack 100 Milliliter Filter sterilisiertes, doppelt destilliertes Wasser für 10 Minuten in das Coplin-Glas.
Während dieser Wäsche, verdünnen Sie die Sonden auf 10 Nanomolar in Hybridisierungspuffer, um die Färbelösung zu schaffen, stellen Sie sicher, 150 Mikroliter Färbung Lösung pro Schlitten vorzubereiten. Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer für jede Sonde vor, indem Sie einem Reservoir einer P1000-Spitzenbox ein durchnässtes, zerknittertes, empfindliches Aufgabenwisch und steriles Wasser hinzufügen. Platzieren Sie die Kipphalterpatrone oben, da hier die Dias sitzen.
Wenn die endige Wäsche abgeschlossen ist, entfernen Sie die Rutsche aus dem Schiebeträger und legen Sie sie auf ein frisches Papiertuch, Gewebeseite nach oben. Verwenden Sie eine empfindliche Aufgabe wischen, um die Rutsche zu trocknen, vorsichtig zu sein, nur sanft in der Nähe, aber nicht auf der Biopsie Abschnitt, um das Wasser abzuleiten. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rahmen um den Biopsiebereich und legen Sie das Diagewebe in die Befeuchtungskammer.
Als nächstes legen Sie die Befeuchtungskammer in einen Brutkasten, der auf 50 Grad Celsius eingestellt ist. Pipette zwischen 50 und 150 Mikroliter der Färbelösung direkt auf dem Gewebe, so dass das Rechteck durch die hydrophobe Grenze um das Gewebe gemacht wird gefüllt und schließen Sie den Kasten sanft. Über Nacht bei 50 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.
Wenn der Inkubator ein Fenster hat, bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie, um eine dunkle Umgebung zu schaffen. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Dias aus den Befeuchtungskammern und leiten Sie alle verbleibenden Hybridisierungslösungen mit einem empfindlichen Aufgabenwisch schnell ab. Legen Sie dann die Seiten in ein vertikales Färbegestell.
Legen Sie das Färbegestell für 10 Minuten in ein mit Aluminiumfolie umwickeltes Coplin-Glas mit 100 Millilitern des vorgewärmten Waschpuffers. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch zwei Mal mit frischem Waschpuffer in neuen Coplin-Gläsern. Bereiten Sie bei diesen Waschschritten den Gegenfleck vor, indem Sie eine Stammlösung von Hoechst 33342 im Waschpuffer im Verhältnis eins zu 1000 verdünnen.
Fügen Sie Alexa-555 Weizenkeim Agglutinin zu einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter und Alexa-555 Phalloidin zu einer Endkonzentration von 33 Nanomolar hinzu. Im Dunkeln lagern, bis sie einsatzbereit sind. Wenn die endige Wäsche abgeschlossen ist, entfernen Sie die Dias aus dem Coplin-Glas und leiten Sie vorsichtig überschüssigen Waschpuffer mit einem empfindlichen Aufgabenwisch ab.
Legen Sie die Dias Gewebeseite auf ein Papiertuch und fügen Sie zwischen 50 und 150 Mikroliter Gegenfleck direkt auf das Gewebe, so dass die hydrophobe Grenze gefüllt ist, aber nicht überlaufen. Bis zu vier Dias mit einem Kryobox-Top bedecken und bei Raumtemperatur 10 Minuten bebrüten. Danach die Dias wieder in den Färbegestell legen und zweimal in Coplin-Gläsern mit frischem Waschpuffer waschen, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauert.
Dann trocknen Sie die Dias gründlich und legen Sie sie Gewebeseite auf ein Papiertuch unter einem Kryobox-Top. Drücken Sie einen Tropfen Montagemedien direkt auf das Gewebe und legen Sie vorsichtig einen entsprechend großen Deckelaufschub darauf. Drücken Sie vorsichtig alle Blasen heraus und lassen Sie die Deckelrutschen über Nacht im Dunkeln aushärten.
Am nächsten Tag die Ränder der Abdeckungen mit einem hellen Mantel aus klarem Nagellack an die Rutsche versiegeln und 10 Minuten im Dunkeln trocknen lassen, bevor man sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln aufbewahrt. Wenn Sie bereit sind, die gefärbten Biopsien abzubilden, schalten Sie das konfokale Mikroskop und die mit dem Mikroskop verbundene Software ein. Beginnen Sie mit einer FISH-Positivfolie und wechseln Sie in den Computervisualisierungsmodus.
Wählen Sie die Kanäle für 405, 488 und 555 aus. Stellen Sie das Loch mit dem längsten Wellenlängenkanal ein, der in diesem Fall 555 beträgt. Dann finden Sie die aktuelle Brennebene zur Visualisierung von markierten Bakterien im 488-Kanal.
Ohne die Fokusebene zu ändern, stellen Sie die Verstärkung, Laserleistung und den Offset für jeden Kanal so ein, dass das Signal nicht gesättigt ist und der Hintergrund nicht überkorrigiert wird. Erfassen Sie das Bild in allen drei Kanälen. In dieser Studie werden gewebeassoziierte Bakterien in menschlichen Blasenbiopsien von 16S rRNA FISH nachgewiesen.
Dieses Protokoll wurde für den unvoreingenommenen Nachweis von Bakterien im Zusammenhang mit der Blasenschleimhaut in paraffin-eingebetteten Blasenbiopsieabschnitten optimiert. Gezeigt sind repräsentative konfokale Mikrographen aus einem Experiment mit diesem Protokoll auf Abschnitten der Blasenbiopsien von Frauen mit wiederkehrenden Harnwegsinfektionen erhalten. Zwei serielle Abschnitte werden entweder mit den universellen 16S rRNA- oder Scramble-Sonden hybridisiert.
Bilder aus der gleichen Region des Gewebes und Bakterien sind sauber im gewebe hybridisiert mit den 16S rRNA Sonden, aber nicht mit der Rührsonde. Falsch positive Ergebnisse sind ebenfalls möglich. In diesem repräsentativen falsch positiven wird in den 405- und 488-Kanälen sowohl in den 16S rRNA- als auch in den Scramble-Sonden-hybridisierten Biopsieabschnitten ein Signal nachgewiesen, das autofluoreszierendem Kollagen oder Elastin entspricht, was die Bedeutung einer immer mit einer Scramble-Sonden-Kontrolle bezeichnet.
Um Photobleichungen zu verhindern, minimieren Sie die Exposition des Gewebes gegenüber Licht, nachdem Sonden aufgetragen wurden. Während diese Technik den unvoreingenommenen Nachweis von Bakterien in menschlichen Geweben ermöglicht, gibt sie keine artenspezifischen Informationen. Multiplex-FISH mit taxonomiespezifischen Sonden könnte verwendet werden, um die Gattung oder die vorhandenen Arten zu identifizieren.
Bevor diese Technik entwickelt wurde, war bisher nicht nachgewiesen worden, dass Bakterien in die Blasenwand menschlicher wiederkehrender UTI-Patienten eindringen konnten. Wir verwenden jetzt Gattungs- und artenspezifische Sonden, um festzustellen, welche Bakterienarten vorhanden sind. Xylole sollten aufgrund ihrer Toxizität in einer Dunstabzugshaube verwendet werden.
Es sollte darauf geachtet werden, während der Bildgebung nicht direkt in den Laser zu schauen. Der Laser sollte ausgeschaltet werden, während Sie Ihre Folie unter dem Objektiv positionieren.
