Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und computergestützte Analysen verwendet, um die Verteilung von synaptischem Protein relativ zu einem Referenzprotein zu bestimmen. Unsere Methode umgeht die inhärente Variabilität von Immunfluoreszenzfärbungen, indem sie ein Verhältnis anstelle von absoluten Fluoreszenzspiegeln verwendet. Zusätzlich können Sie mit dieser Methode die Heterogenität der Proteinverteilung auf verschiedenen Ebenen analysieren.
Von ganzen Hirnscheiben über Hirnregionen bis hin zu sogar Subregionen wie den verschiedenen Schichten des Hippocampus. Diese Technik kann angepasst werden, um die Proteinverteilung in anderen Geweben als dem Gehirn und anderen Modellsystemen als Mäusen zu bestimmen. Beginnen Sie mit dem Waschen zuvor isoliertund fixiert Maus Gehirn, wie in der Handschrift beschrieben.
Dann übertragen Sie das Gehirn auf ein 15 Milliliter Reaktionsrohr mit 30%Saccharose 0,1 Molar PB. Um Kryo schützen das Gehirn inkubieren es bei 4 Grad Celsius für 48 Stunden oder bis es sinkt. Danach verwenden Sie eine scharfe Klinge, um das kryogeschützte Gehirn je nach Interessenbereich zu trimmen. Dann legen Sie das Gehirn in eine Kryoform und fügen Sie optimale Schnitttemperatur Compound, um es zu verankern, um sicherzustellen, Blasen zu vermeiden und das Gehirn richtig zu orientieren, um eine koronare Ebene des Schneidens zu haben.
Legen Sie die Kryoform in den minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank, bis sie fest gefroren ist. Montieren Sie das gefrorene Gewebe auf dem Kryomikrotom und warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie es auf die Mikrotome-Temperatur ausdematrieren. Beginnen Sie, das Gehirn in 25 Mikrometer dicke koronale Scheiben zu schneiden.
Verwenden Sie einen Glashaken an das OCT der ersten Scheibe sorgfältig, ohne das Gehirngewebe zu berühren. Das OCT klebt am Glashaken. Verwenden Sie den Glashaken, um die Gehirnscheibe in den ersten Brunnen zu übertragen.
Sammeln Sie drei benachbarte Scheiben pro Brunnen in einer 24 Brunnenplatte gefüllt mit 0,1 Mol PB. Die Scheiben bei vier Grad Celsius bis zur Färbung bis zu zwei Wochen aufbewahren. Um die Scheiben für die Immunfärbung vorzubereiten, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die PB-Lösung aus einem Brunnen zu entfernen, ohne in die Gehirnscheiben zu ziehen. Verwenden Sie dann eine 1000 Mikroliter Pipette, um 250 Mikroliter frisches PB hinzuzufügen, um sie von überschüssigem OCT zu waschen.
Wiederholen Sie diese Wäsche für jeden Brunnen zu der Zeit, um das Austrocknen der Scheiben zu vermeiden. Verwenden Sie dann eine Kunststoffpipetten, um die PB-Lösung aus dem ersten Brunnen zu entfernen. Verwenden Sie eine 1000 Mikroliter Pipette, um 250 Mikroliter Sperrpuffer pro Brunnen wieder gut funktionieren.
Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur auf einem Shaker für drei Stunden. Während der Inkubation 250 Mikroliter Antikörperpuffer pro Brunnen in ein Reaktionsrohr geben. Verwenden Sie dann eine 2-Mikroliter-Pipette, um die entsprechende Menge an Antikörpern, die sie direkt in die Lösung einfügt, und lassen Sie sie mehrmals vorsichtig nach oben und unten, um sie zu mischen.
Dann wirbeln sie diesen verdünnten Antikörper zu einer unsicheren richtigen Mischung. Gut arbeiten, indem sie den Sperrpuffer mit einer Kunststoffpipette gut entfernen und 250 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung mit einer Kunststoffpipette. Waschen Sie die Scheiben mit 300 Mikroliter Waschpuffer eins pro Brunnen drei mal zehn Minuten jeweils auf einem Shaker bei Raumtemperatur waschen. Während des Waschens, arbeiten im Dunkeln, verdünnen Sie den Fluor für ein paar Sekunden Antikörper in einem Reaktionsrohr in der gleichen Weise wie zuvor mit dem primären Antikörper getan.
Nach dem Waschen den Waschpuffer mit einer Kunststoffpipte entfernen und 250 Mikroliter Sekundärantikörperlösung pro Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Nach der inkubationszeit ende Zeit entfernen Sie die Antikörperlösung mit einer Kunststoffpipette.
Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit Waschpuffer zwei auf die gleiche Weise wie mit Waschpuffer eins. Während dieser Wäsche dAPI Fleck in 0,1 Molaren PB verdünnen, um eine Eins bis 2000 Konzentration zu erreichen. Nach dem Entfernen des Waschpuffers von der Platte 250 Mikroliter DAPI-Lösung hinzufügen und bei Raumtemperatur auf dem Shaker für 5 Minuten inkubieren.
Nach dem Entfernen der DAPI-Lösung mit einer Kunststoffpipette verwenden Sie eine 1000 Mikroliter Pipette, um 500 Mikroliter 0,1 Mol PB pro Brunnen hinzuzufügen. Platzieren Sie ein Mikroskopdia unter einem Stereoskop. Verwenden Sie eine feine Bürste, um drei separate Tropfen von 0,1 Molaren PB auf die Folie hinzuzufügen.
Platzieren Sie mit dem Pinsel eine Scheibe pro Tropfen auf der Folie, und glätten Sie dann die Scheiben und richten Sie sie aus. Nachdem alle Scheiben richtig positioniert sind, verwenden Sie ein Papiergewebe, um überschüssigeS PB zu entfernen und sorgfältig zu trocknen, ohne die Scheiben vollständig zu trocknen. Dann fügen Sie 80 Mikroliter Einbettmedium auf die Folie und bedecken Sie es sorgfältig mit einem Abdeckungsschlupf, um die Gehirnscheiben einzubetten.
Bedecken Sie die Dias, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und lassen Sie sie ein bis zwei Stunden in der Dunstabzugshaube trocknen und lagern Sie sie dann in einer Mikroskop-Diabox bei vier Grad Celsius, bis sie für die konfokale Mikroskopie bereit sind. Nach dem Erwerb virtueller Gewebe des gesamten Gehirns Slice für verschiedene Kanäle, wie im Manuskript beschrieben laden Sie alle einzelnen Kanäle oder ein Bild in FIJI durch Klicken auf Datei und dann öffnen. Verwenden Sie dann das Werkzeug zur freien Handauswahl, um eine Hemisphäre im DAPI-Kanal zu ableiten.
Klicken Sie auf Bearbeiten, dann auswahl, und erstellen Sie dann eine Maske, um eine Maske des ausgewählten Bereichs zu erstellen. Klicken Sie dann auf Analysieren und messen Sie dann Partikel, um die mittlere Fluoreszenzintensität für einzelne Kanäle zu bestimmen. Achten Sie darauf, einzelne Kanäle auszuwählen, um die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte für jeden Kanal zu bestimmen.
Danach kopieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in eine Kalkulationstabelle. Um die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in einem Interessenbereich zu bestimmen, wird der Bereich mit dem Freihandauswahlwerkzeug abgrenzt. Nach der Färbung mit DAPI, die Kerne Gehirnabschnitte flecken haben ein Punktiat-Muster und Regionen mit hoher Zelldichte sind heller als Regionen mit geringer Zelldichte.
Die Färbung mit Mover-Antikörpern zeigte eine heterogene Verteilung mit hellen Hot-Spot-Bereichen und Dimmerbereichen im gesamten Gehirn, wo synaptophysin eine homogenere Verteilung offenbarte. Eine Überlagerung von Bildern zeigte die differenzierte Verteilung der roten Fluoreszenz, die auf Mover-Protein hindeutet, verglichen mit grüner Fluoreszenz, die Synaptophysin anzeigt. Nach der Quantifizierungsanalyse wurden mittlere Fluoreszenzintensitätswerte für verschiedene Kanäle über die Hemisphären und über die Interessengebiete sowohl für Mover als auch für Synaptophysin ermittelt.
Die Verhältnisse der Moverfluoreszenzwerte zu synaptophysin fluoreszenzwerten zeigen die heterogene Verteilung von Mover mit Bereichen mit hohen und niedrigen Mover-Spiegeln im Vergleich zu Synaptischen Vesikeln. Relative Mover Fülle das Verhältnis in einem Bereich von Interesse im Vergleich zu dem über die Hemisphäre und in einem Prozentsatz übersetzt zeigte, wie viel Mover in einem Bereich von Interesse im Verhältnis zum Durchschnitt vorhanden ist. Relative Mover Fülle wurde für verschiedene Schichten in den Unterfeldern des Hippocampus bestimmt.
Die drei Interessengebiete werden quantifiziert, indem das Verhältnis in den jeweiligen Schichten mit dem Verhältnis der entsprechenden Hemisphäre verglichen wird. Dieses Verfahren kann einfach angepasst und mit verschiedenen bildgebenden Verfahren wie der Superauflösungsmikroskopie kombiniert werden, um zusätzlich die subzelluläre Verteilung des proteins von Interesse zu bestimmen. Diese Technik kann auch auf verschiedene Modellsysteme wie gentechnisch veränderte oder mit Drogen behandelte Tiere angewendet werden.
Dies kann einen vergleichenden Ansatz über verschiedene Versuchsbedingungen oder sogar Arten hinweg ermöglichen.
