Wir danken Shao-Ming Lu und Harris A. Gelbard für den Einsatz einer Schlauchpumpe und Vibratom sowie Karen L. Bentley und Gayle Schneider am Elektronenmikroskop Forschung Core Facility der University of Rochester Medical Center für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH (EY019277), Whitehall-Stiftung, Burroughs Wellcome Fund und der Alfred P. Sloan Foundation, um AKM finanziert. M.-È.T. wird durch einen Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Postdoc-Preis finanziert.

1. Tierische Perfusion <ol><li> Am Tag vor der Perfusion, vorzubereiten: - 2 L Phosphatpuffer (PB; 100 mM, pH 7,4) und 1 L Natrium Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,9% NaCl in 50 mM PB, pH 7,4) in doppelt destilliertem Wasser. Bewahren Sie die PBS und 1L PB bei 4 ° C. Diese werden für die Perfusion und Pre-Embedding Immunzytochemie verwendet werden. - 1L von 4,0% Paraformaldehyd (PFA, pH 7,4) Fixierlösung, die die Durchblutung von 6 Mäusen ermöglichen. Zu diesem Zweck aufheizen 1 L PB unter einem Abzug. Wiegen Sie 40 g körniger Paraformaldehyd (PFA) abgemessen und in den PB-Lösung, wenn es 60 ° C erreicht Wenn die Lösung klar ist, mit dem PFA vollständig gelöst, auf Raumtemperatur abkühlen (RT) und bei 4 ° C. </li><li> Am Tag der Perfusion, vorzubereiten 500 ml 3,5% Acrolein Lösung in PB unter einem Abzug. Dann filtern Sie die 3,5% Acrolein und 4,0% PFA-Lösungen mit Filterpapier. </li><li> Für Maus Anästhesie, injizieren Natrium-Pentobarbital (80 mg / kg) in die Bauchhöhle mit einer 27 G ½ &quot;-Nadel. </li><li> Während der Perfusion, 50 ml PBS, werden mit 75 ml Acrolein, und 150 ml PFA nacheinander in der Maus Zirkulation passieren. Zum Einrichten der Schlauchpumpe, füllen Sie den Schlauch mit PBS und fixieren ein 23 gauge ¾ &quot;Butterfly-Nadel an einem Ende. Tauchen Sie das andere Ende des Schlauches in die Perfusionslösung (PBS, Acrolein oder PFA). Stellen Sie die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe auf 20-25 ml / min für jugendliche und erwachsene Mäuse. Während der Perfusion, sorgfältig vermeiden Luftblasen bilden, in den Schlauch. </li><li> Warten Sie, bis die Narkose Maus reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie ein Schwanz kneifen, bevor Sie fortfahren. Legen Sie das Tier in einer Dissektion Fach und befestigen Sie die Pfoten mit Klebeband. Mit Pinzette und Schere, öffnen die Haut und Brustkorb in das Herz aussetzen. Zur Minimierung Hirnischämie, muss die Durchblutung zu schnell gestartet werden. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer kleinen Schere und starten Sie die Schlauchpumpe. Halten Sie die Herzen mit einer Pinzette, legen Sie die Butterfly-Nadel in die Spitze des linken Ventrikels. </li><li> Beim Wechsel Lösung, stoppen Sie die Schlauchpumpe, überweisen Sie den Schlauch von einer Lösung zur anderen, und starten Sie die Pumpe sofort. </li><li> Wenn 150 ml PFA abgelaufen ist, stoppen die Schlauchpumpe. Mit einer kleinen Schere, schnitt den Kopf, öffnen Sie die Haut, und brechen den Schädel zwischen den Augen. Mit Hilfe von kleinen Pinzette vorsichtig Chip in kleine Stücke des Schädels, bis das Gehirn leicht entfernt werden kann. Post-fix das Gehirn für 2 Stunden bei 4 ° C in PFA. Wash 3 mal 10 Minuten in PBS. </li><li> Unmittelbar schneiden das Gehirn in Querrichtung (50 um dicke Schnitte) in eisgekühltem PBS mit einem Vibratom. Mit einem feinen Pinsel, Transfer Abschnitte für Immunzytochemie in einen Glaskolben mit PBS ausgewählt. Bewahren Sie die restlichen Abschnitte bei -20 ° C in Gefrierschutzmittel (30% Ethylenglykol und 30% Glycerin in PBS) für bis zu mehreren Jahren. </li></ol> 2. Pre-Embedding Immunzytochemie <ol><li> Für Immunzytochemie, sind Abschnitte verarbeitet frei schwebend in Glasflaschen. Während des gesamten Verfahrens muss man sorgfältig vermeiden, dass Teile austrocknen. </li><li> Entfernen Sie zuerst den PBS mit einem Transferpipette und sofort mit einer frischen Lösung von 0,1% Natriumborhydrid in PBS für 30 Minuten bei RT zu ersetzen. </li><li> Spülen Sie Abschnitte mit PBS 3 mal 10 Minuten, die Beseitigung aller Blasen, und inkubieren für 2 Stunden bei RT in einer Blockierungslösung PBS mit 0,5% Gelatine und 5% normalem Serum des Tieres, in dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde (normal Ziegenserum in im vorliegenden Beispiel von Iba1-Immunfärbung). </li><li> 48 Stunden lang mit dem primären Antikörper in Blockierungslösung. Für Iba1-Immunfärbung, verwenden Kaninchen-Anti-Iba1 Antikörper (1:1000). </li><li> Spülen Sie Abschnitte mit PBS 3 mal 10 Minuten und inkubieren in Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Biotin (1:1000) in Blocking-Lösung für 2 Stunden bei RT. Für Iba1-Immunfärbung, verwenden Ziege Anti-Kaninchen-IgG. </li><li> Spülen Sie Abschnitte mit PBS 3 mal 10 Minuten und inkubieren in Streptavidin-Meerrettichperoxidase (1:1000) in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei RT. </li><li> Spülen Sie Abschnitte mit PBS 10 Minuten und mit Tris / HCl-gepufferte Kochsalzlösung (TBS, 50 mM, pH 7,4) 2 mal 10 Minuten. Zu offenbaren, die Etikettierung und inkubieren Abschnitte mit 0,05% DAB und 0,01% Wasserstoffperoxid in TBS (Lösung frisch zubereitet). Wenn die Färbung dunkelbraun (siehe Beispiel in Abbildung 1) ist, stoppen Sie die Reaktion durch Spülen in TBS. In jedem Fall Ende der Reaktion nach maximal 5 Minuten. Spülen Sie Abschnitte mit TBS 10 Minuten und mit PB 2 mal 10 Minuten. </li></ol> 3. Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie <ol><li> Transfer-Abschnitte in PB in einer Multiwell Kultur Platte mit einem feinen Pinsel. Bereiten Sie 1% Osmiumtetroxid-Lösung in PB unter einem rauchender Haube. Entfernen PB aus den Vertiefungen der Kulturschale und<html> Verbreitung der Abschnitte Wohnung mit einem feinen Pinsel. Sofort tauchen Abschnitte in 1% Osmium für 30 Minuten bei RT. </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte in Glasflaschen, mit PB 3 mal 10 Minuten spülen und austrocknen durch 2 Minuten Eintauchen in aufsteigender Konzentrationen von Ethanol: 2 mal 35%, 1 Mal je 50%, 70%, 80%, 90%, und 95 %, 3 mal 100%, von 3-mal Propylenoxid gefolgt. </li><li> Zur Vorbereitung der Durcupan Harz, kombiniert 20 g der Komponente A, mix 20 g der Komponente B, 0,6 g der Komponente C, und 0,4 g der Komponente D in eine Einweg-Becher, gut, bis die Farbe wird gleichmäßiger, und gießen Sie in ein Aluminium-wiegen Gericht. Bei Bedarf können Harzblöcke durch Gießen Harz in Einbettformen und Aushärtung in einem 55 ° C im Ofen für 48-72 Stunden hergestellt werden. </li><li> Mit einem feinen Pinsel mit Propylenoxid gespült, entfernen Sie die Abschnitte aus dem Propylenoxid und tauchen Sie ein in die Durcupan Harz zur Imprägnierung über Nacht bei RT. </li><li> Am folgenden Tag legte der Aluminium wiegt Gericht in einem 55 ° C im Ofen für 10 Minuten, um das Harz zu erweichen. Mit einem Pinsel mit Propylenoxid, Beschichtung eines ACLAR Einbettung Film mit einer dünnen Schicht von Harz gespült, legen die Abschnitte, Deckel mit einem anderen Einbettung Film und gleichmäßig zu verteilen leichten Gewichten (ca. 2 g, zum Beispiel die Plastikkappen der Glasfläschchen) auf, um Harz zu verbreiten. Für Harz Polymerisation in den Ofen für 48-72 Stunden (bei 55 ° C) inkubieren. </li><li> Nach der Polymerisation, entfernen Sie den leichten Gewichten und Einbettung Folie auf der Oberseite der Abschnitte. Unter einem Binokular, wählen quadratische Bereiche von Interesse (ca. 2x2 mm) und vorsichtig Verbrauchsteuern sie aus dem Film mit einer Rasierklinge. </li><li> Kleben Sie die Bereiche von Interesse an der Spitze der Harz Blöcke mit Sekundenkleber und Heilung in der 55 ° C im Ofen für 1 Stunde. </li><li> Als Vorbereitung für das Schneiden, schneiden Sie die Harzblock die Form eines gleichschenkligen Trapez mit einer Rasierklinge. </li><li> Mit einem Ultramikrotom und ein Glas Messer, entfernen Sie den Kleber und Harz an der Oberfläche des Gewebes. Füllen Sie das Boot des Glases Messer mit doppelt destilliertem Wasser und schneiden Sie ein paar Semidünnschnitten (0.5-1 &amp;mgr; m dick). </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte zu einem SuperFrost Objektträger mit einer perfekten Schleife. Trocknen Sie die Teile, indem Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 1 Minute. Cover mit ein paar Tropfen von 0,1% Toluidinblau-Färbung (2 g Natrium-Borat und 0,2 g Toluidinblau in 200 ml doppelt destilliertem Wasser) für 1 Minute. Spülen Sie die überschüssige Beize mit doppelt destilliertem Wasser. Die Untersuchung der Schnitte mit einem Lichtmikroskop ermöglicht den gefärbten Gewebeschnitten aus dem Harz (Abb. 2) zu unterscheiden. </li><li> Fortsetzen Schneiden, bis die Grenze zwischen Gewebe und Harz bis zur Mitte der Abschnitte. Beachten Sie, dass die folgende Prozedur Training erfordert. Ersetzen Sie das Glas Messer mit einer Diamant-Messer und füllen das Boot mit doppelt destilliertem Wasser. Cut Silber zu Silber-Gold-Ultradünnschnitte (60-80 nm dick) und sorgfältig sammeln sie auf Kupfer Maschengitter mit feinen Pinzetten invertiert. Trocknen Sie die Gitter auf ein Filterpapier. </li><li> Zur Verbesserung Gegensatz dazu können ultradünne Schnitte mit Bleicitrat (0,03 g Bleicitrat und 0,1 mL 10 N Natronlauge in 10 mL doppelt destilliertem Wasser 1) angefärbt werden. Mit feinen Pinzette invertiert, Transfer ein Gitter zu einem Rückgang der Bleicitrat für 2 Minuten. Entfernen Sie das Gitter und zart in 3 aufeinanderfolgenden Bädern doppelt destilliertem Wasser zu spülen. Schließlich trocknen die Gitter auf ein Filterpapier und speichert sie in einer Gitterbox bis elektronenmikroskopische Untersuchung (Abbildungen 3-6). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Iba1-gefärbte Sektion an der Ampel mikroskopischer Ebene. Die zelluläre Verteilung von Iba1 ist Mikroglia, die die Spezifität der Immunfärbung zeigt beschränkt. Maßstab = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Toluidinblau-gefärbten semi-Dünnschliff an der Ampel mikroskopischer Ebene. Beachten Sie die Grenze zwischen Gewebe und Harz, wo die Immunfärbung erscheinen intensivsten wird am Elektronenmikroskop. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ultradünnschnitt zeigt Iba1-immunpositive Mikroglia Perikaryon und Prozesse bei der elektronenmikroskopischen Ebene. Iba1-positive strukturelle Elemente sind durch ihre Immunperoxidase-DAB Elektronen-dichten Niederschlag erkannt. Maßstab = 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ultradünnschnitt Anzeige Iba1-immunpositive Mikroglia Prozesse der verschiedenen Größen und Formen bei der elektronenmikroskopischen Ebene. Maßstab = 2 um. e 5 &quot;/&gt; Abbildung 5. Ultradünnschnitt zeigt bei stärkerer Vergrößerung ein Iba1-positive Mikroglia Prozess von Abbildung 4, welche die Identifizierung der intrazellulären Organellen. Maßstab = 1 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Ultradünnschnitt enthüllt bei höherer Vergrößerung die ultrastrukturelle Beziehungen zwischen einem Iba1-positive Mikroglia-Prozess und in der Nähe Elemente Neuropil einschließlich Synapsen. Balken = 1 &amp;mgr;.

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	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Hier haben wir ein Protokoll für die Herstellung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie, dass er einen ausgezeichneten Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung und immunzytochemische Nachweis, wenn die Verfahren konsequent durchgeführt liefert beschrieben. Kombiniert mit TEM ermöglicht diese Methode, um zelluläre Elemente mit wenigen Besonderheiten und Identifikation Kriterien zu unterscheiden. Insbesondere ermöglicht die Immunperoxidase-DAB-Färb...

* Man sollte immer unter einem Abzug arbeiten und Nitrilhandschuhe tragen beim Umgang mit Acrolein, Paraformaldehyd und Osmium und sollten auch ihren Müll ordnungsgemäß zu entsorgen.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist äußerst nützlich für die Visualisierung von Mikrogliazellen, oligodendrocytic, Astrozyten und Neuronen subzellulären Kompartimenten (Dendriten, dendritischen Dorn, Axon, Axonterminal, Perikaryon), sowie deren intrazellulären Organellen und Zytoskelett, in das zentrale Nervensystem an hoher räumlicher Auflösung. Kombiniert mit TEM ermöglicht Pre-Embedding Immunzytochemie die Diskriminierung von zellulären Elemente mit wenigen Besonderheiten und Identifikation Kriterien (zB Mikroglia Perikarya und Prozesse, bei Verwendung eines Antikörpers gegen die Mikroglia-Marker Iba1 (ionisiertes Kalzium bindenden Adapter molecule 1; wie dargestellt hier)), die Identifizierung des Neurotransmitters Inhalte der zellulären Elemente (zB Serotonin) und deren ultrastrukturelle Lokalisierung von löslichen oder Membran-gebundenen Proteine ​​(zB 5 HT1A und EphA4-Rezeptoren). Hier beschreiben wir ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen mit Acrolein Fixativ, das Entfernen und Schneiden des Gehirns sowie Immunperoxidase-Diaminobenzidin (DAB)-Färbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte der Hirnschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit TEM. Wenn konsequent durchgeführt wird, bietet diese Technik einen hervorragenden Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung und immunzytochemische Detektion.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K Aufrufe.  University of Rochester. Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.

Serie: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

Kombinierte mechanische und enzymatische Dissoziation von Hippocampusgewebe des Gehirns der Maus

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Tiefengewebs-Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in intaktem Maus- und Zebrafischgehirn

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Zwei-Photonen- und Weitfeld-Kalziumbildgebung im Colliculus superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der neuronalen Kodierung und der Mechanismen der visuellen Verarbeitung im Colliculus superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...