Unser High-Throughput-Assay ergänzt die verfügbaren Methoden zur Identifizierung kleiner Moleküle und ihrer Ziele, die die TCR-Signalisierung und T-Zell-Aktivierung modulieren. Unser Assay hat einen selbstkorrigierenden Aspekt durch das Herausfiltern toxischer Verbindungen und die Identifizierung von Inhibitoren der TCR-Signalisierung und Stimulations-induzierten Apoptose. Die Identifizierung von Mediatoren der TCR-Signalisierung kann bei der Entwicklung der Therapie bei Immunerkrankungen helfen.
Wir lieferten einen starken Stimulus für Thymosyten, die von TCR-polyklonalen Mäusen abgeleitet wurden. Es ist möglich, TCR-transgene Mäuse zu verwenden und sie mit anderen Peptid-Ligand-Tetrameren für eine schwächere Stimulation zu stimulieren. Dieser Test beinhaltet die Verwendung von kleinen Volumen und von kleinvolumigen Platten für die Kultivierung der Zellen.
Dies erfordert einen sorgfältigen Umgang mit den Platten und ihrem Inhalt. Es gibt viele Verbindungen in der Bibliothek von Kinase-Inhibitoren, die als gefährlich gelten. Behandeln Sie aus Sicherheitsgründen alle Verbindungen als gleich gefährlich und befolgen Sie die vom Lieferanten empfohlenen Sicherheitsvorkehrungen.
Um die Behandlung von Thymosyten mit Kinase-Inhibitoren zu beginnen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 40 Mikroliter pro Brunnen Thymosyten zu einer Kleinbandplatte hinzuzufügen. Legen Sie die Platte auf Eis. Dann Pipette einen Teil der Kinase-Inhibitoren, DMSO, und Dexamethason, und vier Teile der gesamten RPMI-Medien in eine 96-Well-Platte.
Legen Sie acht Brunnen der Kleinvolumenplatte für unbehandelte Kontrollen fest, vier Brunnen für Dexamethason-behandelte Positivkontrollen für den Zelltod, indem Sie das verdünnte Dexamethason bei der Fünf-Mikromolar-Konzentration hinzufügen, und vier Brunnen zu fahrzeugbehandelten Kontrollen, indem Sie 0,5 Mikroliter des verdünnten DMSO hinzufügen. Als nächstes, aus den entsprechenden Brunnen der Inhibitorplatte, fügen Sie 0,5 Mikroliter jedes verdünnten Inhibitors auf die 96-Well-Platte. Um mit der Thymosytenstimulation zu beginnen, stellen Sie zunächst sicher, dass Anti-CD-3- und CD-28-Perlen gleichmäßig wieder aufgehängt werden.
Als nächstes waschen Sie einen Milliliter der Perlen mit zwei Millilitern des PBS-Puffers. Setzen Sie die Röhre auf einen magnetischen Ständer, um Perlen von Überstand zu trennen und die Lösung zu aspirieren. Dann die Perlen in einem Milliliter des gesamten RPMI-Mediums wieder aussetzen.
Fügen Sie 10 Mikroliter pro Bohrkörper der Perlensuspension zu jeder inhibitorbehandelten Probe, den vier DMSO-behandelten Proben und vier der acht unbehandelten Proben hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter des gesamten RPMI zu den verbleibenden vier unbehandelten Brunnen hinzu. Verwenden Sie einen Mikroplatten-Orbital-Shaker, um die Platte sanft zu erregen.
Als nächstes inkubieren Sie die Thymosyten in 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Umgebung für 17 bis 20 Stunden, oder über Nacht. Prime eine automatisierte laminare Durchflussplattenscheibe, zuerst mit 150 Milliliter Ethanol Tween Lösung, dann mit entionisiertem Wasser ergänzt mit 1%Tween 20, und schließlich mit FACS Waschpuffer. Am Ende der Inkubation mit dem Plattenwaschsystem die Platte mit FACS Waschpuffer mit einem neunfachen Waschzyklus waschen.
Jede Wäsche fügt 55 Mikroliter Waschpuffer durch laminaren Fluss hinzu und entfernt sie, was zu einer exponentiellen Verdünnung der Reagenzien in den Brunnen führt. Um Oberflächenantigene zu färben, verdünnen Sie zunächst ein Einheitsvolumen von Anti-CD-3, Anti-CD-4, Anti-CD-8 und Anti-CD-69-Antikörpern in 100-Einheiten-Volumen des FACS-Waschpuffers. Dann die Zellen in 25 Mikroliter des Färbeantikörpergemisches wieder aufhängen.
Verwenden Sie einen Mikroplatten-Orbital-Shaker, um die Platte sanft zu erregen, und lassen Sie die Platte dann 30 Minuten lang auf Eis. Um die Zellen zu fixieren, waschen Sie zuerst die Platte mit 55 Mikroliter FACS Waschpuffer mit neunfachen Waschzyklus wie zuvor beschrieben. Dann fügen Sie 50 Mikroliter des Fixierungs-Impermeablisationspuffers zu jedem Brunnen hinzu.
Gut mischen und die Platte 30 Minuten auf Eis bebrüten. Nach der Inkubation einen Ein-X-Perm und Waschpuffer vorbereiten, indem Sie 25 Milliliter des mitgelieferten 10-Fach-Lagerbestands in 225 Milliliter Reinstwasser verdünnen. Die Plattenscheibe mit einem 1-X-Puffer grundieren und mit 55 Mikrolitern des Ein-X-Puffers mit einem neunfachen Waschzyklus wie zuvor beschrieben waschen.
Zunächst einen Milliliter des Anti-Caspase-3-Antikörpers mit zwei Millilitern des 1-X-Perm und Waschpuffers mischen. Fügen Sie 25 Mikroliter pro Brunnen der Mischung zu den festen Zellen hinzu. Verwenden Sie einen Mikroplatten-Orbital-Shaker, um die Platte sanft zu erregen.
Lassen Sie die Platte für eine Stunde auf Eis. Am Ende der Inkubation wiederholen Sie den Waschschritt neunmal mit dem Ein-X-Perm und dem Waschpuffer. Dann 25 Mikroliter des FACS Waschpuffers in alle Brunnen der Platte geben.
Pipette ein paar Mal nach oben und unten, um die Lösung zu mischen. Schließlich übertragen Sie die gemischten Proben in Mikrotiter-Röhren. Die Rohre mit dem FACS-Waschpuffer auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern aufladen und mit der Durchflusszytometrieanalyse fortfahren.
Nach Anti-CD-3, CD-28 Stimulation wurde eine Erhöhung der Caspase-3-Aktivierung und der TCR-Downregulation sowohl in den unbehandelten als auch in den DMSO-Mock-behandelten Proben beobachtet. Auch wurde eine Zunahme der CD-69-Expression in beiden stimulierten Proben beobachtet. Die mit Dexamethason behandelten Proben zeigten eine Erhöhung der Caspase-3-Aktivierung unabhängig von der CD-69-Upregulation, wie für die unabhängige apoptoseinduzierende Wirkung und die TCR-Stimulation erwartet.
Die selektive Beeinträchtigung von T-Zell-Aktivierungsphänomenen wurde durch verschiedene Inhibitoren gezeigt, die entweder sowohl die Caspase-3-Aktivierung als auch die CD-69-Up-Regulation unterdrückten oder die CD-69-Up-Regulierung behinderten, aber die Caspase-3-Aktivierung nicht beeinträchtigten. Es gab auch Inhibitoren, die nicht auf eine relevante Kinase des TCR-Signalwegs abzielten und daher sowohl die CD-69-Upregulation als auch die Caspase-3-Aktivierung nicht unterdrückten. Das Bildschirmergebnis von Staurosporin, der Apoptose-positiv-Kontrolle, zeigte erwartungsgemäß einen hohen Grad an Caspase-3-Aktivierung.
Das Ergebnis zeigte jedoch auch niedrige Konzentrationen der CD-69-Expression, die entweder auf seine vermittelte Hemmung der Proteinkinase C oder auf ihre induzierte Apoptose vor der CD-69-Expression zurückgeführt werden können. Der Vergleich verschiedener Assayprotokolle zeigte keine Unterschiede bei der aktiven Caspase-3-, CD-69- und TCR-Färbung der Negativkontrolle, der positiven Kontrolle des Zelltodes, der Fahrzeugkontrolle und einer inhibitorbehandelten Probe. Die Vorinkubationsstufen sollen die Verwendung der Kleinbandplatte zur Zellkultivierung erleichtern.
Das standardzentrifugenabhängige Protokoll ist auch im Manuskript vorgesehen. Potenziell interessante Inhibitoren oder Targets können mit verschiedenen Zelltypen und auch bei verschiedenen Arten, wie z. B. pagopheralen Mauslymphozyten oder menschlichen Primärzellen, validiert werden. Die anschließende Charakterisierung der identifizierten Moleküle und der Targets kann dazu beitragen, das Verständnis der T-Zellbiologie zu verbessern und mögliche Ziele für die Immunmodulation zu erweitern.
