Il nostro saggio ad alta produttività si aggiunge ai metodi disponibili per l'identificazione di piccole molecole e dei loro obiettivi che modulano la segnalazione TCR e l'attivazione delle cellule T. Il nostro saggio ha un aspetto auto-correttivo filtrando i composti tossici e identificando gli inibitori della segnalazione TCR e dell'apoptosi indotta dalla stimolazione. L'identificazione di mediatori della segnalazione TCR può aiutare nello sviluppo della terapia per le malattie immunitarie.
Abbiamo fornito un forte stimolo per i timociti derivati da topi TCR-policlonali. È possibile utilizzare topi TCR-transgenici e stimolarli con altri tetrameri del ligando peptidico per una stimolazione più debole. Questo saggio prevede l'uso di piccoli volumi e di lastre di piccolo volume per la coltivazione delle cellule.
Ciò richiede un'attenta movimentazione delle piastre e del suo contenuto. Ci sono molti composti nella libreria di inibitori della chinasi che sono considerati pericolosi. Per motivi di sicurezza, trattare tutti i composti come ugualmente pericolosi e seguire le precauzioni di sicurezza raccomandate dal fornitore.
Per iniziare il trattamento dei timociti con inibitori della chinasi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 40 microlitri per pozzo di timociti a una piastra di piccolo volume. Metti il piatto sul ghiaccio. Quindi pipettare una parte degli inibitori della chinasi, DMSO e desametasone, e quattro parti del supporto RPMI completo in una piastra a 96 potte.
Designare otto pozzi della piastra di piccolo volume a comandi non trattati, quattro pozzi per i controlli positivi trattati con desametasone per la morte cellulare aggiungendo il desametasone diluito alla concentrazione di cinque micromolare e quattro pozzi ai comandi trattati con veicolo, aggiungendo 0,5 microlitri del DMSO diluito. Successivamente, dai pozzi corrispondenti della piastra inibitore, aggiungere 0,5 microlitri di ogni inibitore diluito alla piastra da 96 po '. Per iniziare la stimolazione del timocita, assicurarsi prima che le perline anti-CD-3 e CD-28 siano sospese uniformemente.
Quindi, lavare un millilitro delle perline con due millilitri del tampone PBS. Mettere il tubo su un supporto magnetico per separare le perline dal supernatante e aspirare la soluzione. Quindi sospendere di nuovo le perline in un millilitro del mezzo RPMI completo.
Aggiungere 10 microlitri per pozzo della sospensione del tallone a ciascun campione trattato con inibitori, ai quattro campioni trattati con DMSO e a quattro degli otto campioni non trattati. Aggiungere 10 microlitri dell'RPMI completo ai restanti quattro pozzi non trattati. Utilizzare uno shaker orbitale a micropiastra per agitare delicatamente la piastra.
Successivamente, incubare i timociti in 37 gradi Celsius e 5% di ambiente di anidride carbonica per 17-20 ore o durante la notte. Innescare una rondella automatica a flusso laminare, prima con 150 millilitri di soluzione Tween di etanolo, poi con acqua deionizzata integrata con 1%Tween 20 e, infine, con tampone di lavaggio FACS. Al termine dell'incubazione utilizzando il sistema di lavaggio della piastra, lavare la piastra con tampone di lavaggio FACS utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte.
Ogni lavaggio aggiunge e rimuove 55 microlitri di tampone di lavaggio per flusso laminare, con conseguente diluizione esponenziale dei reagenti nei pozzi. Per macchiare gli antigeni superficiali, diluire prima un volume unitario di anticorpi anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 e anti-CD-69 in volumi di 100 unità del tampone di lavaggio FACS. Quindi sospendere di nuovo le cellule in 25 microlitri della miscela di anticorpi di colorazione.
Utilizzare uno shaker orbitale micropiastra per agitare delicatamente la piastra, quindi lasciare la piastra sul ghiaccio per 30 minuti. Per fissare le celle, lavare prima la piastra con 55 microlitri di tampone di lavaggio FACS utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte superiore a quello descritto in precedenza. Quindi aggiungere 50 microlitri del buffer di fissazione-impermeablizzazione ad ogni pozzo.
Mescolare bene e incubare il piatto sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, preparare una X perm e lavare il tampone diluire 25 millilitri dello stock 10X fornito in 225 millilitri di acqua Ultrapure. Innescare la rondella con tampone one-X e lavare la piastra con 55 microlitri del tampone one-X utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte come descritto in precedenza.
Per iniziare, mescolare un millilitro dell'anticorpo anti-caspasi 3 con due millilitri del perm one-X e del tampone di lavaggio. Aggiungere 25 microliter per pozzo della miscela alle celle fisse. Utilizzare uno shaker orbitale a micropiastra per agitare delicatamente la piastra.
Lasciare il piatto sul ghiaccio per un'ora. Al termine dell'incubazione, ripetere il passaggio di lavaggio nove volte con l'una X perm e il tampone di lavaggio. Quindi aggiungere 25 microlitri del tampone di lavaggio FACS a tutti i pozzi della piastra.
Pipetta su e giù un paio di volte per mescolare la soluzione. Infine, trasferire i campioni misti in tubi a microtitoro. Ricaricare i tubi con il tampone di lavaggio FACS fino a un volume totale di 200 microlitri e procedere all'analisi della citometria del flusso.
A seguito della stimolazione anti-CD-3, CD-28, è stato osservato un aumento dell'attivazione della caspasi-3 e la downregolazione TCR sia nei campioni non trattati che in quello pretrattato DMSO. Inoltre, è stato osservato un aumento dell'espressione del CD-69 in entrambi i campioni stimolati. I campioni trattati con desametasone hanno mostrato un aumento dell'attivazione della caspasi-3 indipendente dall'upregolazione cd-69, come previsto per l'effetto indipendente che induce l'apoptosi e la stimolazione TCR.
La compromissione selettiva dei fenomeni di attivazione delle cellule T è stata mostrata da diversi inibitori che hanno soppresso sia l'attivazione della caspasi-3 che l'up-regulation del CD-69, o l'up-regulation del CD-69, ma non hanno compromesso l'attivazione della caspasi-3. C'erano anche inibitori che non miravano a una chinasi rilevante della via di segnalazione TCR, e quindi non sopprimevano sia l'upregolazione CD-69 che l'attivazione della caspasi-3. Il risultato dello schermo della staurosporina, il controllo positivo all'apoptosi, ha mostrato alti livelli di attivazione della caspasi-3, come previsto.
Tuttavia, il risultato ha anche mostrato bassi livelli di espressione cd-69 che possono essere attribuiti alla sua inibizione mediata della protein chinasi C o alla sua apoptosi indotta prima dell'espressione cd-69. Il confronto di diversi protocolli di dosaggio non ha mostrato differenze nella colorazione attiva della caspasi-3, CD-69 e TCR del controllo negativo, del controllo positivo per la morte cellulare, del controllo del veicolo e di un campione trattato con inibitori. Le fasi di pre-incubazione hanno lo scopo di facilitare l'uso della piastra di piccolo volume per la lavorazione delle cellule.
Il protocollo standard dipendente dalla centrifuga è fornito anche nel manoscritto. Inibitori o bersagli potenzialmente interessanti possono essere convalidati utilizzando diversi tipi di cellule e anche in diverse specie, come i linfociti pagoferali del topo o le cellule primarie umane. La successiva caratterizzazione delle molecole identificate e degli obiettivi può aiutare a migliorare la comprensione della biologia delle cellule T ed espandere i possibili obiettivi per l'immunomodulazione.
