Nuestro ensayo de alto rendimiento se suma a los métodos disponibles para la identificación de moléculas pequeñas y sus objetivos que modulan la señalización TCR y la activación de células T. Nuestro ensayo tiene un aspecto autocorridente a través de la filtración de compuestos tóxicos y la identificación de inhibidores de la señalización TCR y la apoptosis inducida por la estimulación. La identificación de mediadores de la señalización TCR puede ayudar en el desarrollo de la terapia para enfermedades inmunitarias.
Proporcionamos un fuerte estímulo para los timocitos derivados de ratones TCR-policlonal. Es posible utilizar ratones transgénicos TCR y estimularlos con otros tetrámeros de ligando péptidos para una estimulación más débil. Este ensayo implica el uso de pequeños volúmenes y de placas de pequeño volumen para el cultivo de las células.
Esto requiere un manejo cuidadoso de las placas y su contenido. Hay muchos compuestos en la biblioteca de inhibidores de la quinasa que se consideran peligrosos. Por motivos de seguridad, trate todos los compuestos como igualmente peligrosos y siga las precauciones de seguridad recomendadas por el proveedor.
Para comenzar el tratamiento de los timocitos con inhibidores de la quinasa, utilice una pipeta multicanal para añadir 40 microlitros por pozo de timocitos a una placa de pequeño volumen. Pon el plato en hielo. A continuación, pipetear una parte de los inhibidores de la quinasa, DMSO y dexametasona, y cuatro partes del medio RPMI completo en una placa de 96 pozos.
Designar ocho pozos de la placa de pequeño volumen a los controles no tratados, cuatro pozos a controles positivos tratados con dexametasona para la muerte celular mediante la adición de la dexametasona diluida a la concentración de cinco micromolares, y cuatro pozos a los controles tratados con vehículos, mediante la adición de 0,5 microlitros de la DMSO diluida. A continuación, a partir de los pozos correspondientes de la placa inhibidora, añadir 0,5 microlitros de cada inhibidor diluido a la placa de 96 pozos. Para comenzar la estimulación de los timocitos, primero asegúrese de que las perlas anti-CD-3 y CD-28 estén suspendidas uniformemente.
A continuación, lave un mililitro de las cuentas con dos mililitros del tampón PBS. Coloque el tubo en un soporte magnético para separar las perlas del sobrenadante y aspirar la solución. A continuación, vuelva a suspender las perlas en un mililitro del medio RPMI completo.
Agregue 10 microlitros por pozo de la suspensión del cordón a cada muestra tratada con inhibidores, las cuatro muestras tratadas con DMSO y cuatro de las ocho muestras no tratadas. Agregue 10 microlitros de la RPMI completa a los cuatro pozos no tratados restantes. Utilice un agitador orbital de microplaca para agitar suavemente la placa.
A continuación, incubar los timocitos en 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 17 a 20 horas, o durante la noche. En primer lugar, una arandela automática de placas de flujo laminar, primero con 150 mililitros de solución Tween de etanol, luego con agua desionizada complementada con 1%Tween 20, y finalmente, con tampón de lavado FACS. Al final de la incubación con el sistema de lavado de placas, lave la placa con la tampón de lavado FACS utilizando un ciclo de lavado nueve veces.
Cada lavado añade y elimina 55 microlitros de tampón de lavado por flujo laminar, lo que resulta en una dilución exponencial de los reactivos en los pozos. Para manchar los antígenos superficiales, primero diluya un volumen unitario de anticuerpos anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 y anti-CD-69 en volúmenes de 100 unidades del tampón de lavado FACS. Luego vuelva a suspender las células en 25 microlitros de la mezcla de anticuerpos de tinción.
Utilice un agitador orbital de microplaca para agitar suavemente la placa y luego deje la placa sobre hielo durante 30 minutos. Para fijar las células, primero lave la placa con 55 microlitros de tampón de lavado FACS utilizando un ciclo de lavado nueve veces como se describió anteriormente. A continuación, agregue 50 microlitros del búfer de fijación-impermeablización a cada pozo.
Mezclar bien e incubar la placa sobre hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, preparar una perm de una X y un tampón de lavado diluyendo 25 mililitros del stock 10X proporcionado en 225 mililitros de agua Ultrapura. Enaprecia la arandela de placas con un tampón de X y lave la placa con 55 microlitros del tampón one-X utilizando un ciclo de lavado de nueve veces como se describió anteriormente.
Para comenzar, mezcle un mililitro del anticuerpo anti-caspasa 3 con dos mililitros de la perm de uno X y el tampón de lavado. Añadir 25 microlitros por pozo de la mezcla a las células fijas. Utilice un agitador orbital de microplaca para agitar suavemente la placa.
Deje el plato sobre hielo durante una hora. Al final de la incubación, repita el paso de lavado nueve veces con la perm de uno-X y el tampón de lavado. A continuación, agregue 25 microlitros del tampón de lavado FACS a todos los pozos de la placa.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar la solución. Por último, transfiera las muestras mezcladas a tubos de microtíter. Remate los tubos con el tampón de lavado FACS a un volumen total de 200 microlitros, y proceda al análisis de citometría de flujo.
Tras la estimulación anti-CD-3, CD-28, se observó un aumento en la activación de la caspasa-3 y la regulación de la regulación del TCR tanto en las muestras no tratadas como en las muestras tratadas con simulacros DMSO. Además, se observó un aumento de la expresión de CD-69 en ambas muestras estimuladas. Las muestras tratadas con dexametasona mostraron un aumento en la activación de la caspasa-3 independiente de la regulación ascendente de CD-69, como se esperaba para el efecto inductor independiente de la apoptosis y la estimulación de TCR.
El deterioro selectivo de los fenómenos de activación de células T fue mostrado por diferentes inhibidores que suprimieron tanto la activación de la caspasa-3 como la actualización de CD-69, o inhibieron la actualización de CD-69, pero no afectaron la activación de la caspasa-3. También hubo inhibidores que no apuntaban a una quinasa relevante de la vía de señalización TCR, y por lo tanto no suprimieron tanto la regulación ascendente CD-69 como la activación de la caspasa-3. El resultado de la pantalla de la estaurosporina, el control apoptosis-positivo, mostró altos niveles de activación de la caspasa-3, como se esperaba.
Sin embargo, el resultado también mostró bajos niveles de expresión de CD-69 que se pueden atribuir a su inhibición mediada de la proteína quinasa C o a su apoptosis inducida antes de la expresión cd-69. La comparación de diferentes protocolos de ensayo no mostró diferencias en la tinción activa de caspasa-3, CD-69 y TCR del control negativo, el control positivo de la muerte celular, el control del vehículo y una muestra tratada con inhibidores. Las etapas de pre-incubación están destinadas a facilitar el uso de la placa de pequeño volumen para el cultivo de las células.
El protocolo estándar dependiente de la centrífuga también se proporciona en el manuscrito. Los inhibidores o objetivos potencialmente interesantes pueden ser validados usando diferentes tipos de células y también en diferentes especies, como linfocitos de ratón pagoféricos o células primarias humanas. La caracterización posterior de las moléculas identificadas y los objetivos puede ayudar a mejorar la comprensión de la biología de las células T y ampliar los posibles objetivos de la inmunomodulación.
