התפוקה הגבוהה שלנו מוסיפה לשיטות הזמינות לזיהוי מולקולות קטנות ולמטרות שלהן המווסתות איתות TCR והפעלת תאי T. להערכה שלנו יש היבט של תיקון עצמי באמצעות סינון תרכובות רעילות וזיהוי מעכבי איתות TCR ו אפופטוזיס הנגרמת על ידי גירוי. זיהוי של מתווכים של איתות TCR יכול לסייע בהתפתחויות של טיפול במחלות חיסוניות.
סיפקנו גירוי חזק עבור thymocytes נגזר עכברים TCR-polyclonal. ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים TCR ולעורר אותם עם tetramers ליגנד פפטיד אחרים עבור גירוי חלש יותר. ההתקף הזה כרוך בשימוש בכמויות קטנות ובצלחות בנפח קטן לפולחן התאים.
זה מחייב טיפול זהיר של הצלחות ותכולתו. ישנם תרכובות רבות בספרייה של מעכבי קינאז אשר נחשבים מסוכנים. משיקולי בטיחות, התייחסו לכל התרכובות כמסוכנות באותה מידה, ופעלו בהתאם לאמצעי הבטיחות המומלצים של הספק.
כדי להתחיל את הטיפול thymocytes עם מעכבי קינאז, להשתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 40 microliters לכל באר של thymocytes לצלחת נפח קטן. שים את הצלחת על קרח. ואז פיפטה חלק אחד של מעכבי קינאז, DMSO, ו dexamethasone, וארבעה חלקים של מדיה RPMI מלא לתוך צלחת 96 היטב.
ייעוד שמונה בארות של הלוח בנפח קטן לפקדים לא מטופלים, ארבע בארות לפקדים חיוביים שטופלו dexamethasone למוות של תאים על ידי הוספת dexamethasone מדולל בריכוז של חמישה מיקרומולרים, וארבע בארות לפקדים שטופלו ברכב, על ידי הוספת 0.5 microliters של DMSO מדולל. לאחר מכן, מן הבאר המתאימה של צלחת מעכב, להוסיף 0.5 microliters של כל מעכב מדולל לצלחת 96 היטב. כדי להתחיל גירוי thymocyte, תחילה ודא נגד CD-3 ו CD-28 חרוזים מושעים מחדש באופן אחיד.
לאחר מכן, לשטוף מיליליטר אחד של חרוזים עם שני מיליליטר של חיץ PBS. שים את הצינור על מעמד מגנטי כדי להפריד חרוזים מן supernatant ולשאפת את הפתרון. ואז להשעות מחדש את חרוזים במיליליטר אחד של מדיום RPMI מלא.
הוסיפו 10 מיקרוליטרים לבאגם של מתלי חרוזים לכל דגימה שטופלה על ידי מעכבים, ארבע הדגימות שטופלו ב-DMSO וארבע מתוך שמונת הדגימות שלא טופלו. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של ה-RPMI המלא לארבעת הבירות הנותרות שלא טופלו. השתמש שייקר מסלולית מיקרופלאט כדי להתסיס בעדינות את הצלחת.
לאחר מכן, הדגירה thymocytes ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה במשך 17 עד 20 שעות, או לילה. ראש מכונת כביסה אוטומטית לזרימת למינאר, תחילה עם 150 מיליליטר של פתרון אתנול Tween, לאחר מכן עם מים deionized בתוספת 1%Tween 20, ולבסוף, עם חיץ לשטוף FACS. בסוף הדגירה באמצעות מערכת מכונת הכביסה צלחת, לשטוף את הצלחת עם חיץ לשטוף FACS באמצעות מחזור כביסה תשע פעמים.
כל שטיפה מוסיפה ומסיר 55 microliters של חיץ לשטוף על ידי זרימה למינארית, וכתוצאה מכך דילול מעריכי של reagents בארות. כדי להכתים אנטיגנים פני השטח, תחילה לדלל נפח יחידה אחת של אנטי-CD-3, אנטי-CD-4, אנטי-CD-8, ונוגדנים נגד CD-69 באמצעי אחסון של 100 יחידות של מאגר לשטוף FACS. ואז להשעות מחדש את התאים ב 25 microliters של תערובת נוגדנים מכתים.
השתמש שייקר מסלולית מיקרופלאט בעדינות להתסיס את הצלחת, ולאחר מכן להשאיר את הצלחת על הקרח במשך 30 דקות. כדי לתקן את התאים, לשטוף תחילה את הצלחת עם 55 microliters של מאגר לשטוף FACS באמצעות מחזור כביסה תשע פעמים כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מאגר האימפוליזציה של קיבעון לכל באר.
מערבבים היטב להחגירה את הצלחת על הקרח במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הכינו סולן חד-X ושטפו חיץ על ידי דילול 25 מיליליטר של מלאי ה-10X שסופק ב-225 מיליליטר של מים Ultrapure. ראש מכונת הכביסה צלחת עם חיץ אחד X ולשטוף את הצלחת עם 55 microliters של חיץ X אחד באמצעות מחזור כביסה תשע פעמים כמתואר קודם לכן.
כדי להתחיל, לערבב מיליליטר אחד של נוגדן נגד caspase 3 עם שני מיליליטר של פרם X אחד ואת חיץ לשטוף. מוסיפים 25 מיקרוליטר לגם של התערובת לתאים הקבועים. השתמש שייקר מסלולית מיקרופלאט כדי להתסיס בעדינות את הצלחת.
תשאיר את הצלחת על הקרח למשך שעה. בסוף הדגירה, חזור על שלב הכביסה תשע פעמים עם perm X אחד ומאגר לשטוף. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה FACS לכל בארות הצלחת.
פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון. לבסוף, להעביר את הדגימות המעורבות לתוך צינורות microtiter. הברג את הצינורות עם מאגר הכביסה של FACS לנפח כולל של 200 מיקרוליטרים, והמשך לניתוח ציטומטריית הזרימה.
בעקבות אנטי CD-3, גירוי CD-28, עלייה בהפעלת Caspase-3 ואת רגולציה TCR נצפו הן בדגימות מטופלות והן DMSO ללעוג. כמו כן, עלייה בביטוי CD-69 נצפתה בשתי הדגימות מגורה. הדגימות שטופלו dexamethasone הראו עלייה בהפעלת CASPASE-3 ללא תלות ב- CD-69 upregulation, כצפוי עבור אפקט אפופטוזיס עצמאי וגירוי TCR.
הפגיעה הסלקטיבית בתופעות הפעלת תאי T הוכחה על ידי מעכבים שונים שהדחיקה הן את הפעלת Caspase-3 והן את תקנת CD-69, או את רגולציית CD-69 מעוכבים, אך לא פגעה בהפעלת Caspase-3. היו גם מעכבים שלא למקד קינאז רלוונטי של מסלול איתות TCR, ולכן לא לדכא הן CD-69 upregulation ו caspase-3 הפעלה. תוצאת המסך של staurosporine, השליטה החיובית אפופטוזיס, הראה רמות גבוהות של הפעלת caspase-3, כצפוי.
עם זאת, התוצאה גם הראתה רמות נמוכות של ביטוי CD-69 שניתן לייחס או עיכוב מתווך של חלבון קינאז C או אפופטוזיס המושרה שלה לפני ביטוי CD-69. השוואה בין פרוטוקולי התקנה שונים לא הראתה הבדלים בקאספסה-3 פעילה, CD-69 וכתמי TCR של הבקרה השלילית, השליטה החיובית במוות התא, בקרת הרכב ודגימה שטופלה במעכבים. שלבי טרום הדגירה נועדו להקל על השימוש בצלחת בנפח קטן עבור culturing של התאים.
הפרוטוקול הסטנדרטי התלוי בצנטריפוגה ניתן גם בכתב היד. מעכבים או מטרות שעשויים להיות מעניינים יכולים להיות מאומתים באמצעות סוגי תאים שונים וגם במינים שונים, כגון לימפוציטים עכבר פגופרי או תאים ראשוניים אנושיים. אפיון עוקב של המולקולות שזוהו והיעדים יכולים לעזור לשפר את ההבנה של ביולוגיה של תאי T ולהרחיב על מטרות אפשריות לאימונומודולציה.
