Unser Protokoll beschreibt, wie eine Peptid-dotierte Biomembran zusammenbaut und elektrisch charakterisiert wird, die die Zusammensetzung, Struktur und Transporteigenschaften biologischer Synapsen genau imitiert und eine einstellbare Speicherresistenz aufweist. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, aktivitätsabhängige, Speicherresistenz und kurzfristige Plastizität in technischen Systemen in Zeitskalen und Anregungsniveaus zu bewerten, die für biologische Synapsen und Ionenkanäle relevant sind. Diese Technik bietet einen Rahmen für die Charakterisierung biomimetischer Membranen, die spannungsaktivierte Ionenkanäle enthalten, wodurch sie auf die Charakterisierung einer Vielzahl von zellulären Transportprozessen anwendbar ist, einschließlich derer in Neuronen.
Unser Vorschlag an neue Forscher ist es, zunächst bei der Vorbereitung von Liposomenlösungen und der Montage einer Tröpfchenschnittstelle Bilayer auf Drahtelektroden zu werden. Das Aus erster Hand zu sehen, das Verfahren zum Tröpfchendosieren und Positionieren auf Elektroden vereinfacht diese Technik für die Bilayer-Bildung und macht sie sofort für alle zugänglich. Demonstriert dieses Verfahren wird Dr.Joseph Najem, ein Postdoc aus meinem Labor, demonstrieren.
Zunächst bereiten Sie die Alamethicin-Stammlösung im Mikrozentrifugenrohr vor, indem Sie das Alamethicin-Peptidepulver in Ethanol auf eine Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter auflösen. Wirbeln Sie die Röhre kurz, um gut zu mischen, und speichern Sie die Lagerlösung in einem minus 20 Grad Celsius Gefrierschrank. In einem 1,5 Milliliter Safe-Lock-Rohr einen Mikroliter Alamethicin-Stammlösung zu 99 Mikroliter lösung A hinzufügen, um eine endgültige Alamethicin-Konzentration von 13 Mikromolar in der Liposomensuspension zu erreichen.
Wirbel gut zu mischen. Die resultierende Peptid-Liposomlösung ist Die Lösung B.Mix 117 Mikroliter der Lösung A mit 10 Mikroliter n. A. Lösung B, um eine endgültige Alamethicin-Konzentration von einem Mikromolar zu erreichen, und dann Wirbel, um gut zu mischen. Beziehen Sie sich auf die resultierende Lösung als C.Store die Lösungen B und C bei vier Grad Celsius.
Legen Sie eine 1 Millimeter dicke 25 mal 75 Millimeter große Glasseite auf die Bühne eines invertierten Mikroskops. Geben Sie ein paar Tropfen Hexadecanöl auf die Mitte der Glasrutsche, und legen Sie dann das Ölreservoir direkt auf das Öl auf der Glasrutsche. Füllen Sie das Ölreservoir vollständig mit Hexadecanöl.
Stellen Sie sicher, dass das Reservoir über der Objektivlinse positioniert ist. Dann stecken Sie den Elektrodenhalter an die Kopfstufe eines Stromverstärkers, der auf einem Mikromanipulator montiert ist. Der Mikromanipulator minimiert Elektrodenlänge und elektrisches Rauschen.
Dann montieren Sie den Glasmikropipette-Halter mit dem zweiten Silber-Silber-Chlorid-Draht auf einen anderen Mikromanipulator. Positionieren Sie die Elektroden mit Hilfe der Mikromanipulatoren so, dass die agarosebeschichteten Spitzen der Silber-Silber-Chlorid-Drähte auf einer ähnlichen vertikalen Ebene vollständig in das Ölreservoir eingetaucht sind. Richten Sie die beiden Elektroden aus und trennen Sie sie um einige Millimeter.
Um die Lipid-Doppelschicht zu bilden, bewegen Sie die Elektroden vertikal in die Ölphase. Verwenden Sie die Mikropipette, um 200 Nanoliter Lipidlösung A auf jedem der Drähte abzulagern. Warten Sie drei bis fünf Minuten, bis eine spontane Lipid-Monolayer-Montage an der Wasserölschnittstelle möglich ist.
Tröpfchen können absacken, wenn das umgebende Öl ausreichend dichter ist. Danach senken Sie die Elektroden wieder untertauchen, bis die Enden beider Elektroden kaum den Boden des Ölreservoirs berühren. Um dann die Bilayer zu bilden, bewegen Sie die Elektroden horizontal, um die Tröpfchen in Kontakt zu bringen.
Um die eingeklemmte, hysteretische Strom-Spannungs-Beziehung zu erhalten, verwenden Sie einen Funktionsgenerator, um dreieckige oder sinusförmige Spannungswellenform auf eine alamethicinfreie Lipidmembran anzuwenden, die mit Tröpfchen der Lösung A. montiert ist. Um die Größe der Grenzflächen-Lipid-Bilayer aufzuzeichnen, messen Sie entweder den Durchmesser der Lipidmembran auf dem Computer oder erfassen Sie die Peak-to-Peak-Stromamplitude, die sich aus der dreieckigen Welle von 10 Hertz, 10 Millivolt ergibt, um die Fläche der Membran zu berechnen. Nehmen Sie die Drähte aus der Ölphase, um die Tröpfchen zu entfernen, die kein Alamethicin enthalten.
Fügen Sie neue wässrige Tröpfchen mit Lösung C hinzu und bilden Sie eine Lipid-Bilayer. Verwenden Sie anhand der quadratischen Wellenstromamplitude die Mikromanipulatoren, um den Kontakt zwischen Tröpfchen so einzustellen, dass die Bilayerin eine ähnliche Fläche hat wie die zuvor gebildete. Wenden Sie dann eine Spannungswellenform von 10 Hertz und 10 Millivolt an und zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion wie bisher auf.
Um Pulsexperimente mit einer benutzerdefinierten Programmiersoftware und analoger Spannungsquelle durchzuführen, erzeugen Sie Spannungsimpulse mit spezifischen hohen und niedrigen Amplituden auf Zeit und Auszeit. Zeichnen Sie den Strom als Reaktion auf angewendete Impulse auf. Das Diagramm von Strom versus Spannung zeigt die Null-Strom-Antwort bei Anwendung einer Spannungsverzerrung auf eine alamethicinfreie Lipid-Bilayer.
Fügen Sie 0,017 Hertz hinzu, eine Frequenz, bei der die Impedanz durch Membranwiderstand dominiert wird. Für die hochisolierende Membran wird eine geringe ohmsche Stromreaktion angezeigt. Die Darstellung eines Lipid-Doppelschichtens, das zwischen zwei Tröpfchen gebildet wird, die Alamethicin-Peptide enthalten, zeigt exponentiell steigende Ströme bei Spannungen, die über der Einfügeschwelle von 100 Millivolt liegen.
Bei Hochspannung, Alamethicin Peptide an der Oberfläche des Lipid-Doppelschichteinsatz es in die Membran und Aggregat zu leitenden Poren bilden. Die symmetrischen Stromreaktionen bei beiden Polaritäten sind auf das Einfügen und Die Aggregation separater Populationen von Peptiden von gegenüberliegenden Seiten der Membran zurückzuführen. Der kapazitive Strom muss vom Gesamtstrom subtrahiert werden, um nur die memristive, eingeklemmte Hysterese-Strom-Spannungs-Antwort zu erhalten.
Die biomolekulare Memristor-Reaktion auf nachfolgende Spannungsimpulse mit einer Erhöhung der Leitfähigkeit während der Betriebszeit, obwohl sie während jeder Auszeit zeitweise einen Isolierzustand wiederherstellt. Sowohl der gegenwärtige Stimulus als auch die vorherigen Reize tragen zum aktuellen Anstieg bei. Kohäsive Monolayer auf beiden Tröpfchen müssen sich bilden, bevor sie zu der Bilayerin zusammengeführt werden.
Wenn die Tröpfchen zu früh zusammengebracht werden, verschmelzen sie und es bildet sich kein Zweischichter. Wir entwerfen und fertigen jetzt mikrofluidische Basis-Neuralnetze, die aus Festkörper-Neuronen bestehen, die durch membranbasierte Synapsen verbunden sind, die durch netzwerkassimilationoptimierung von Hochleistungs-Supercomputern bei ORNL unterstützt werden. Diese Memristoren sind die ersten, die die Zusammensetzung, Struktur, Schaltmechanismus und Ionentransport von biologischen Synapsen haben.
Sie bieten somit eine biomolekulare Basis, die mit hirnähnlichem Rechnen und Gedächtnis ausgestattet ist.
