Die Autoren möchten sich Zoiray Technologies Inc., ein Co-Sponsor und Vermarktungspartner für ihre Unterstützung danken.

1. Untergrundvorbereitung <ol><li> Coat geschichtete Silizium-SiO 2-Substraten mit Selbst-Adsorption Copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Copolymer-Synthese, chemische Struktur und Coating-Verfahren sind publiziert in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Charakterisierung eines polymeren Adsorbed Coating für DNA Microarray Slides Glas. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> Kurz gesagt, bereiten Polymerlösung durch Zugabe von 100 mg des Polymers zu 5 ml deionisiertem Wasser (DI) und mit 5 ml 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ((NH 4) 2 SO 4)-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,92 M. zu erreichen </li><li> Tauchen Sie Chips in-Lösung für 30 min auf einem Schüttler und dann gründlich mit VE-Wasser. Dry gründlich mit Argon / N 2-Gas. </li><li> Bake-Chips bei 80 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Shop-Polymer-beschichtete Substrate / Chips in einer trockenen Umgebung (Vakuumexsikkator) für bis zu 3 Monaten bis Sonde Spotting Verfahren. </li></ol> 2. Vorbereitung der Probe Array: Antikörper, Antigene, ss / dsDNA, RNA, etc. <ol><li> Verdünnen Sie die Sonde (n) geeignete Konzentration in der gewünschten Puffer. Dieser Schritt kann erheblich variieren, aber ein typisches Experiment nutzt Antigen oder IgG in einer Konzentration von 0,5 mg / ml (Bereich von 0,1 -1 mg / mL) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH ≈ 7,4. </li><li> Place Lösungen in einer 96 - oder 384-Well-Platte (oder Standard-Source-Platte für den Spotter verwendet wird) </li><li> Setup-Spotting-Parameter für die gewünschte gedruckt Array: Bestimmung der geeigneten Spotting-Parameter für die Oberfläche und Lösungen verwendet wird (Verweilzeiten, Annäherungsgeschwindigkeiten, etc.). Bestimmen Sie die Anzahl der Wiederholungen der einzelnen Bedingung pro Raster, die Grid-Layout, die Anzahl der zu replizieren Gitter, und die gewünschte Spotting Lage auf dem Chip. Legen Substrate und Quelle Platte an den entsprechenden Stellen, stellen Sie sicher, Abfall-und Vorratsflaschen sind bereit, und dem Druck beginnen laufen. </li><li> Nach Spotting fertig ist Platz Substrate in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit über Nacht (4-18 Stunden), damit Immobilisierung und Deaktivierung durchgeführt werden soll. </li><li> Wash Substrate: legen Sie sie in den folgenden Lösungen für die drei Minuten für drei separate Wäschen: PBS mit 0,1% Tween (PBST), PBS und schließlich deionisiertem Wasser (DI). Je nach der Art des Experiments (wet vs trocken), trocken der Chip gründlich mit Argon Gas und beginnen Inkubation oder den Chip in einer Flusskammer und zu montieren. </li><li> Deaktivieren verbleibenden NHS-Gruppen auf Copolymer Oberfläche durch Eintauchen der Chips in einem 50 mM Lösung von Ethanolamin mit dem pH-Wert eingestellt auf 7,4 für 30 Minuten, während auf einem Schüttler Platte. Ein primäres Amin-haltige Verbindung wie Hydroxylamin oder Tris können ebenfalls verwendet werden, solange die vorbereitete Lösung ist sicher, mit Proteinen verwendet werden. Spülen Sie die Deaktivierung Lösung mit PBS dann VE-Wasser. </li><li> Optional Schritt (abhängig von der Oberflächenchemie zu beschäftigt): Block Oberfläche mit einer Lösung von BSA, Casein oder rehydriert Milch für 30 Minuten. Für das laufende polymeren Oberflächen-Chemie, die wir verwenden, haben wir diesen Schritt nicht ausführen, wie das Polymerrückgrat wirkt, um nicht-spezifische Protein-Bindung zu verhindern. </li></ol> 3. Datenerfassung und-Incubation Vorgehensweise: Endpoint-Format <ol><li> Machen Sie eine Lösung des Ziels von Interesse in der gewünschten Puffer. Hier wird es eine Lösung des entsprechenden Konzentration von Anti-BSA in PBS (: make 1-10 mL einer 10 ng / ml-Lösung von Anti-BSA in PBS ex) werden. Stellen Sie außerdem sicher, um eine äquivalente Menge an Puffer (ohne Ziel) für die negative Kontrolle Inkubationszeit haben. </li><li> Werfen Sie einen Silizium-Spiegel-Scan für die Normalisierung der alle nachfolgend erhobenen Daten. </li><li> Scan der vorbereiteten Probe Array mit dem IRIS-System vor der Inkubation Schritt, um die erste optische Höhe (Masse) an jedem Ort zu bestimmen. Dies wird für eine ordnungsgemäße Analyse von Veränderungen in der Masse auf der Oberfläche zu ermöglichen, dh der Grad der Bindung, nach der Inkubation. Hier werden einige Parameter für das laufende Experiment, wie Belichtungszeit, Sichtfeld, prosperierenden konzentrieren, etc. eingestellt werden </li><li> Tauchen Chip (s) in vorbereitete Lösung für 1 Stunde auf einem Schüttler Platte. Die Inkubationszeit kann variieren stark je nach dem Grad der Erregung, die Konzentration der Ziel erkannt, die Transporteigenschaften der Flusskammer (wenn eine Echtzeit-Erkennung-Modus verwendet wird), die Affinitäten der Target-Sonden-Paar, etc . </li><li> Nach der Inkubationszeit, wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 2.5 beschrieben) </li><li> Scan der gleichen Sonde Array mit dem IRIS-System und erhalten nach der Inkubation Bilder für Vorinkubation Vergleich. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Inkubationsschritte wenn nötig, zum Beispiel in einem Sandwich-Assay-Format, wo ein sekundärer Antikörper verwendet wird. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Fit die gesammelten Bilder für jede IRIS-Scan (Reihenfolge der Intensität Bilder), mit dem Labor-entwickelten Software zur ProDuce ein Bild von der Sonde Array mit optischen Dicke Informationen. Eine schnelle qualitative Analyse der Bindung kann durch Subtraktion (eingetragene) Post-und Pre-Inkubation Bilder durchgeführt werden. Binding wird als eine Änderung in der Intensität an den Stellen, wo Masse Veränderungen beobachtet erscheinen. Für die quantitative Analyse ermitteln Massendichten jeder Stelle im Vergleich zum Hintergrund durch Mittelung optische Dicke Informationen für jedes Pixel in einem Spot-und einen Ring außerhalb des Ortes und machen einen direkten Vergleich dieser beiden Bereiche. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 zeigt ein Beispiel schematische Darstellung des geschichteten Si-SiO 2 IRIS Substrat mit einem Vertreter Antikörper Array entdeckt. Jeder Antikörper Ensemble ist in replizieren mit Spezifität für ein anderes Epitop gezielt verschiedene Proteine ​​entdeckt. Zwei verschiedene ganze Viren und ein virales Protein als Beispiel Ziele vertreten. Negative Kontroll-Antikörper richten sich nach dem Test und kann nicht-spezifische und / oder Virus-spezifisch. Abbildung 2 zeigt die Bindung von humanem Serum Albumin (HSA)-spezifische Antikörper gegen eine Reihe von spotted HSA und Kaninchen IgG (Kontrolle) Flecken. Wie hier zu sehen, nach der Montage und Bestimmung der optischen Dicken für die Pre-und Post-Inkubation Bilder, kann einen Unterschied Bild für die Bindung Array erstellt qualitativ beurteilen verbindlich. Die quantitative Analyse zeigt, dass ein 2,05 und 0,13 Nanometer mittlere optische Höhenänderung für die HSA und Kaninchen-IgG-Spots wurde beobachtet, die für eine Anti-HSA Inkubation Konzentration von 500 ng / mL. Abbildung 3 zeigt ein IRIS Messung Fur Proteinbindung Abhängigkeit von Proteinkonzentration und dsDNA Oligomer Länge. Die obere Grafik zeigt absolute optische Höhenmessungen für die erste immobilisierten Oligomers Sonde Höhen-und Post-Inkubation Fur bindend. Steigende Konzentrationen von Pelz (50, 100, 200 nM) führte zu einer erhöhten Bindung an DNA-Sonden. Die Länge der Oligomere auch Auswirkungen Fur Bindung mit längeren Sequenzen was zu mehr bindend. Hier sind auf Fehler und Bars eine Standardabweichung vom Mittelwert. Die untere Kurve zeigt berechnet Fur-Protein-Dimer binden pro dsDNA Strang. Dimer-Bindung wurde deutlich bei einem Fur-Protein-Konzentration von 200 nM auf eine hohe Ebene der nicht-spezifische Bindung erhöht. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schematische Darstellung eines Beispiels Sondenarray normalerweise in einem Experiment zur spezifischen Viren und viralen Komponenten in einem Multiplex-Mode mit dem IRIS-System erkannt werden. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Post-Inkubation Unterschied die Grafik für eine Bindung von humanen Serum-Albumin-spezifischen Antikörpern gegen gesichtet HSA mit diesem Label-free-System bei einer Konzentration von 500 ng / mL gesammelt. Das Biomaterial Massendichte für jeden Fleck wird durch Mittelung optische Dicke Informationen innerhalb einer Stelle und dann einen Vergleich mit dem Durchschnitt von einem Ring um den Ort, die den Hintergrund bestimmt. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Plot der Bindung von Daten für die Fur-Protein-Wechselwirkungen mit gefleckten doppelsträngige Oligomere mit einem bekannten Konsensus-Sequenz auf Oligomer Länge, Lage der Konsensus-Sequenz innerhalb des Oligomers und Fur-Protein-Konzentration. Informationen über die absolute Höhe der Fur-Protein gebunden, um jedes entdeckte Sequenz (oben) können verwendet werden, um die Zahl der Pelz-Dimere gebunden an jede Art von Oligomer (unten) zu schätzen.

<ol>
	<li>&#214;zkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications.">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li><li>&#214;zkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches.">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li><li>&#214;zkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed,+high-throughput,+label-free,+and+dynamic+biosensing+platform.">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li><li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., &#214;zkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging.">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li></ol>

Die IRIS-Plattform ist eine einfache und schnelle System für das Sammeln High-Throughput-Bindung von Daten in einem Mikroarray-Format zu verwenden. Durch kovalent immobilisiert verschiedenen funktionalen Protein-oder DNA-Sonden auf einer Oberfläche, Zielantigene / Biomarker / etc. kann aus der Lösung aufgenommen werden, wie in einem Immunoassay. Die Messung dieser Interaktionen über Sonde Bedingungen in einem Endpunkt oder Echtzeit-Format mit der IRIS-System ermöglicht hochempfindliche und quantitative Informationen für jede Interaktion gesammelt werden. Der Vertreter Experiment detaillierte hier ist nur ein Beispiel für die Arten von Wechselwirkungen, die mit dieser Technik untersucht werden können. Detektion von Transkriptionsfaktoren, virale Antigene, und ganze Viren zuvor und zeigte stellt nur ein paar Beispiele für die Arten von Analysen, die IRIS leicht umgehen kann.

<ol><li> Silizium-Wafer mit 500 nm von thermisch-grown Siliziumdioxid, Silicon Valley Microelectronics, kundenspezifischen Auftrag <li> Ammoniumsulfat-Pulver, Sigma-Aldrich Katze. # A5132 <li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10X bereit zu konzentrieren, Fisher Scientific Katze. # BP665-1 <li> Antikörper gegen das humane Serumalbumin (Anti-HSA), Sigma-Aldrich Katze. # A0433 <li> Humanes Serum Albumin (HSA), Sigma-Aldrich Katze. # A9511 <li> Argon oder Stickstoff (ultra-hohe Reinheit), Airgas Katze. # AR UHP300 oder # NI UHP300 <li> Petrischalen, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific Katze. # 0875713A <li> Scienceware ® Vakuum-Exsikkator, Sigma-Aldrich Katze. # Z119016 <li> Reaktionsgefäße, Fisher Scientific Katze. # 05-408-120 <li> 96-Well-Platten, geringe Zell-Bindung, Nalgene Nunc International Katze. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Ethanolamin, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hydroxylamin, Thermo Scientific Katze. # 26103 <li> Mehrzweck-Rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), Modell # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R-Kamera, QImaging Katze. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> ACULED Beleuchtungsquelle, PerkinElmer, kundenspezifischen Auftrag <li> Optische Komponenten (Linsen, Objektiven, Blenden-, Schienen-, Post, etc.), Thorlabs </ol>

biomolecular detection employing the interferometric reflectance imaging sensor (iris)

Die empfindliche Messung von biomolekularen Wechselwirkungen hat den Einsatz in vielen Bereichen und Branchen wie Grundlagen der Biologie und Mikrobiologie, Umwelt / Landwirtschaft / Biodefense Überwachung, Nanobiotechnologie und vieles mehr. Für diagnostische Anwendungen, Monitoring (Erfassung) das Vorhandensein, Fehlen oder abnormale Expression gezielt Proteomik oder genomischen Biomarkern in Patientenproben gefunden werden verwendet, um Behandlungsansätze oder Therapie Wirksamkeit zu bestimmen. In der Forschung arena, sind Informationen über molekulare Affinitäten und Spezifitäten für voll Charakterisierung der untersuchten Systeme nützlich. Viele der aktuellen Systeme eingesetzt, um molekulare Konzentrationen oder Affinitäten zu bestimmen verlassen sich auf die Verwendung von Etiketten. Beispiele für diese Systeme umfassen Immunoassays wie die Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Techniken,-Gel-Elektrophorese-Assays und Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen sind diese Etiketten fluoreszierend, radiologischen oder kolorimetrischen in der Natur und sind direkt oder indirekt auf die molekulare Ziel von Interesse angebracht. Obwohl die Verwendung von Etiketten allgemein anerkannt und hat einige Vorteile, es gibt auch Nachteile, die Förderung der Entwicklung von neuen Label-freie Methoden zur Messung dieser Wechselwirkungen. Diese Nachteile gehören praktische Aspekte wie erhöhte Assay Kosten Reagenz Lebensdauer und Benutzerfreundlichkeit, die Lagerung und Sicherheit betrifft, verschwendet Zeit und Mühe bei der Etikettierung, und die Variabilität zwischen den verschiedenen Reagenzien aufgrund der Kennzeichnung Prozesse oder Etiketten selber. Auf einer wissenschaftlichen Grundlage, kann der Einsatz dieser Etiketten auch vorstellen Schwierigkeiten wie Bedenken mit Auswirkungen auf die Funktion des Proteins / Struktur durch die Anwesenheit des angeschlossenen Labels und die Unfähigkeit zur direkten Messung der Interaktionen in Echtzeit. Präsentiert hier ist die Verwendung eines neuen Label-freien optischen Biosensor, dass zugänglich Studien Microarray ist, bezeichnet der interferometrischen Reflectance Imaging Sensor (IRIS), zum Nachweis von Proteinen, DNA, antigenen Materials, ganze Krankheitserreger (Virionen) und anderes biologisches Material. Die IRIS-System wurde gezeigt, dass eine hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit bei verschiedenen biomolekularen Wechselwirkungen [1-3] haben. Die Vorteile sind Multiplex-Imaging-Fähigkeit, Echtzeit-und Endpunkt Messmöglichkeiten und andere High-Throughput-Attribute wie reduzierte Reagenzienverbrauch und eine Reduktion der Untersuchungszeit Zeiten. Darüber hinaus ist die IRIS-Plattform einfach zu bedienen, erfordert kostengünstige Geräte und nutzt Silizium-basierten Festphasenassays Komponenten macht es kompatibel mit vielen zeitgenössischen Oberflächenchemie Ansätze. Hier präsentieren wir die Verwendung des IRIS-Systems von der Vorbereitung der Sonden-Arrays zur Inkubation und Messung von Ziel-Bindung an der Analyse der Ergebnisse in einem Endpunkt-Format. Das Modell-System wird die Aufnahme des Ziels Antikörper, die spezifisch für humanes Serum Albumin (HSA) auf HSA-spotted Substrate sind.

Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS at JoVE.com

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Quantitative, High-Throughput-, Echtzeit-und Label-free biomolekularen Erkennung (DNA, Proteine, etc.) auf SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Oberflächen kann mit Hilfe einer einfachen interferometrische Technik, die auf LED-Beleuchtung setzt, minimale optische Komponenten und eine Kamera sein. Die interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS) ist kostengünstig, einfach zu bedienen und zugänglich Formate Microarray.

Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

14.5K Aufrufe.  Boston University. Quantitative, High-Throughput-, Echtzeit-und Label-free biomolekularen Erkennung (DNA, Proteine, etc.) auf SiO 2 Oberflächen kann mit Hilfe einer einfachen interferometrische Technik, die auf LED-Beleuchtung setzt, minimale optische Komponenten und eine Kamera sein. Die interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS) ist kostengünstig, einfach zu bedienen und zugänglich Formate Microarray.

Serie: Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

Konstruktion und Herstellung eines Elastomer-Einheit für Soft Modular Robots in die Minimal Invasive Chirurgie

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

Methanol unabhängigen Ausdruck von Pichia Pastoris de-Unterdrückung Technologien

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Auswertung photosynthetischer Verhaltensweisen durch gleichzeitige Messungen von Blattreflexion simultanen und Chlorophyllfluoreszenzanalysen

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...