Dieses Protokoll kann verwendet und weiterentwickelt werden, um zu analysieren, wie ionisierende Strahlung die Rekrutierung von Tumorzellen beeinflusst, was zu einem besseren Verständnis des Krebsrezidivs führt. Mamma-Organoide sind mächtige Modelle. Sie imitieren grundlegende In-vivo-Eigenschaften, ermöglichen aber eine einfache Isolierung biologischer Variablen.
Die Verwendung von Platten mit geringer Haftung negiert die Herausforderungen des Arbeitsflusses im Zusammenhang mit Proteinmatrizen. Dreifach-negative Brustkrebspatientinnen erleben nach der Therapie ein regionales Rezidiv mit höheren Raten. Die Untersuchung, wie Strahlung das Verhalten von Tumoren und Immunzellen beeinflusst, führt zu wichtigen Erkenntnissen über Rezidivmechanismen.
Die konfokale Mikroskopie der Organoide demonstriert Javier Gomez, ein Student im Silvera Batista Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Entfernung von Bauch- und Leistenbrustdrüsen von geopferten Mäusen, wie im Textprotokoll beschrieben. 45 Minuten nach beeisteln der Proben, wie im Textprotokoll beschrieben, Brustdrüsen in eine 35-Millimeter-Sterilzellplatte legen und mit Skalpellen zerkleinern.
Mince mit ca. 40 Strichen, bis sich das Gewebe entspannt und Stücke erhalten werden, die nicht größer als etwa einen Quadratmillimeter fläche sind. Übertragen Sie nun das Gewebe in eine 50-Milliliter-Zentrifugenröhre zur Kollagenaselösung. Verwenden Sie 10 Milliliter Kollagenase-Lösung pro Maus.
Die Probenröhrchen 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad geben und alle 10 Minuten fünf Sekunden wirbeln. Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die Kollagenase-Lösung trüb ist. Drehen Sie die verdaute Lösung bei 450-mal-G für 10 Minuten bei Raumtemperatur herunter.
Nun werden drei Schichten beobachtet. Der Überstand besteht aus Fett, die mittlere Schicht ist eine wässrige Lösung, und der Boden ist ein Pellet. Das Pellet erscheint rot, da es sich um eine Mischung aus Epithelzellen, einzelnen Stromalzellen und roten Blutkörperchen handelt.
Alle Pipetten, Pipettenspitzen und Zentrifugenrohre vor dem Kontakt durch Zugabe und Entfernung der BSA-Lösung vorlacken. BSA-Lösung kann wiederverwendet werden, obwohl sie vor jedem Experiment sterilgefiltert werden sollte. Für eine zusätzliche Erholung übertragen Sie den Überstand auf ein frisches BSA-beschichtetes 15-Milliliter-Rohr.
Pipette nach oben und unten kräftig, um die Fettschicht zu zerstreuen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 450-mal-G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie eine kleine Menge Medien in der Röhre, um zu vermeiden, das Zellpellet zu aspimitieren.
Nun die wässrige Schicht aus dem Rohr mit dem originalen Pellet ansaugen. 10 Milliliter DMEM/F12 mit dem Originalpellet in das Rohr geben und in das zweite Rohr übertragen. Pipette kräftig zu kombinieren und wieder aussetzen die beiden Pellets.
Nach zentrifugieren bei 450-mal-G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie vier Milliliter DMEM/F12 in die Röhre. 40 Mikroliter Desoxyribonuklease in die Suspension geben und bei Raumtemperatur zwei bis fünf Minuten lang sanft von Hand schütteln. Sechs Milliliter DMEM/F12 und Pipette gründlich hinzufügen.
Nachdem Sie das Rohr bei 450-mal-G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren, den Überstand auf die 0,5-Milliliter-Marke ansaugen. Das Pellet in 10 Milliliter DMEM/F12 und Pipette gründlich aufhängen. Zentrifugieren Sie nun das Rohr, indem Sie auf 450-mal-G pulsieren und vier Sekunden nach Erreichen dieser Geschwindigkeit anhalten.
Wiederholen Sie die Waschschritte noch dreimal, um Organoide durch Zentrifugaldifferenzierung zu reinigen. Das Pellet sollte nun eine weiße Farbe sein, die nur aus epitheliale Organoiden besteht. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter DMEM/F12 wieder auf.
Pipette gründlich, um eine homogene Lösung zu schaffen. 50 Mikroliter auf eine 30-Millimeter-Petrischale übertragen und mit 20X unter einem Phasenkontrastmikroskop betrachten. Zählen Sie die Anzahl der Organoide mit einem Zähler.
Pipette 50 Mikroliter Organoide in jeden Brunnen einer Low-Adhäsionsplatte. Fügen Sie 150 Mikroliter organoides Medium hinzu, um das Gesamtarbeitsvolumen auf 200 Mikroliter zu erhöhen. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage sorgfältig.
Halten Sie GFP oder D-Tomaten-markierte rohe 264.7 Makrophagen in DMEM-Medien, ergänzt mit 10%FPS und 1%penicillin-streptomycin. Säen Sie die Zellen in das Organoidmedium mit der gewünschten Dichte. Verwenden Sie Live-Zellphasenkontrast und fluoreszierende Bildgebung, um die Makrophageninfiltration im Laufe der Zeit zu überwachen.
Entfernen Sie das organoide Medium aus den Brunnen, indem Sie sorgfältig anheben. Fixieren Sie die Proben mit 10% neutral gepuffertem Formalin für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die festen Organoide dreimal für fünf Minuten in 1X PBS.
Auf Wunsch können feste Proben bei vier Grad Celsius für eine Woche zur weiteren Färbung gelagert werden. Nach dem Waschen die fixen Organoide fünf Minuten lang permeabilisieren. Blockieren Sie die festen Organoide mit 5% normalem Ziegenserum in 0,1% PBST für eine Stunde bei Raumtemperatur, bevor sie dreimal für fünf Minuten mit PBS gewaschen werden.
Inkubieren Sie die festen Organoide mit Anti-Cytokeratin-14, E-Cadherin, oder engen-Kreuzung-Protein ein, in 1%NGS in PBST für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann dreimal für fünf Minuten in PBST waschen. Jetzt inkubieren Sie die Organoide mit Ziegenanti-Kaninchen Sekundärantikörper mit 1%NGS PBST für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Abdeckung mit Folie, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Nach dem Waschen wie zuvor, verwenden Sie den Kernfarbstoff, um Kerne für etwa eine halbe Stunde zu färben. Waschen Sie die gefärbten Organoide für fünf Minuten in PBS dreimal.
Wenn Sie eine Kammerrutsche verwenden, montieren Sie mit einem Deckelschlupf. Bewahren Sie die in Folie gewickelten Organoide bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius auf. Bestrahlte Organoide könnten in Niederadhäsionsplatten oder innerhalb der Kellermembran kultiviert werden, aber das schnellste Wachstum trat in Platten mit niedriger Haftung auf.
Organoide rekapitulierten Brustdrüseneigenschaften. Es wurden Konstrukte beobachtet, die den Kanälen und Lappen morphologisch ähnlich sind. Wachstumstrends zeigten, dass, wenn Organoide sofort nach der Verdauung und Sortierung ausgesät wurden, nicht bestrahlte Organoide schneller wuchsen als bestrahlte Organoide, wahrscheinlich aufgrund des Zellwachstumsstillstands, der sich aus Mechanismen der REPARATUR von DNA-Schäden ergab.
Organoide exprimierten epitheliale Eigenschaften, die durch immunfluoreszierende Färbung bewertet wurden. Bestrahlte Organoide exprimierten Epithelmarker. Cytokeratin-14, ein Marker von Myoepithel, wurde stark auf der Oberfläche der bestrahlten Organoide ausgedrückt.
Zusätzlich wurden E-Cadherin und Enge-Kreuzung-Protein eins in zellulären Knoten von Organoiden exprimiert. Diese Proteine sind wichtig für die richtige Zellhaftung. Nach der Bestrahlung behielten die Organoide ihre epitheliale Eigenschaften bei.
Fluoreszierende Färbung von Organoiden könnte in Niedrighaftungsplatten mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Die klarste Visualisierung wurde jedoch durch konfokale Mikroskopie erzielt. Die korrigierte Gesamtfluoreszenzintensität wurde berechnet, indem der Hintergrund subtrahiert und nach Organoidbereich normalisiert wurde.
Wachsende Organoide in den 96-Well-Low-Adhäsionsplatten vereinfachten auch Co-Kultur-Experimente. Bei der Aussaat in Konzentrationen, die typisch für die Brustdrüse sind, nahm die Makrophagenkolokalisierung mit bestrahlten Organoiden zu. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, die Organoide nicht zu verdauen und die Zentrifugaldifferenzierung entsprechend zu reinigen.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Co-Kultur-Experimente durchgeführt werden. Organoide können mit Tumorzellen, anderen Immunzellen und Stromalzellen kokultiviert werden, um die bestrahlte Mikroumgebung, die mit einem Rezidiv verbunden ist, nachzubilden. Diese Methode wird wichtig für die Bewertung, wie normale Gewebeschäden speziell beeinflusst Immunzelldynamik, und wird schließlich verwendet werden, um Tumorzell Rekrutierungsmechanismen zu verstehen.
Mamma-Organoide haben Mechanismen der Entwicklung der Brustdrüse aufgeklärt und haben Brustkrebs in vitro robust rekapituliert. Wir hoffen, dass unser Modell Einblicke in die strahlungsinduzierte Tumorzellrekrutierung bietet.
