Diese Methode kann helfen, die Schritte im DNA-Strangaustausch zu entschlüsseln und zeigt die Molekülrollen verschiedener Proteine, die während der Reparatur an der Kombination beteiligt sind. Mit dieser Technik können wir den AUSTAUSCH von DNA-Strängen in Echtzeit ohne Unterbrechung der Reaktion überwachen und den Operationssaal nutzen, um die Kinetik jedes Reaktionsschritts zu bestimmen. Mit einigen geringfügigen Anpassungen kann diese Technik angewendet werden, um die Aktivitäten von gereinigten Rekombinationsproteinen zu untersuchen, die von anderen Arten wie Säugetieren und Pflanzen gewonnen wurden.
Demonstriert wird das Verfahren von Kentaro Ito, einem Post-Doc aus meinem Labor. Bereiten Sie zunächst den Reaktionspuffer A entsprechend dem Textprotokoll vor. Als nächstes fügen Sie 36-Nanomol 16FA-Oligonukleotid in den Puffer für den DNA-Pairing-Test.
Die Mischung bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. RAD-51-Protein in einer Endkonzentration von 1,5 Mikromolen in die Mischung geben und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. SWI5-SFR1-Protein in einer Endkonzentration von 0,15 Mikromolen in die Mischung geben und bei 37 Grad Celsius für weitere fünf Minuten brüten.
1,5 Milliliter des Gemischs in eine 1,0 mal 1,0 cm große Quarzküvette mit Magnetrührer geben. Setzen Sie die Küvette in ein Spektrofluorometer ein und stellen Sie den Temperaturregler und den Magnetrührer ein. Erfassen Sie die Veränderung der FAM-Fluoreszenzemission bei Anregung bei Anregung bei 493 Nanometern in einer Sekunde In- und Rhythmusintervall für 100 Sekunden.
Schließlich injizieren Sie mit einer Spritze ROX-markierte doppelsträngige DNA in einer Endkonzentration von 36 Nanomolen in die Küvette. Zeichnen Sie die Veränderung der Fluoreszenzemission in einer Sekunde Intervall für 30 Minuten auf. Um die Fluoreszenzspektren zwischen den Substraten und den Endprodukten zu vergleichen, legen Sie jede Küvette mit den 16 FA-Oligonukleotiden mit oder ohne RAD-51 in ein Spektrofluorometer ein und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Zeichnen Sie dann die FAM-Fluoreszenzemission bei Anregung bei 493 Nanometern bei 500 bis 600 Nanometern auf. Um die Wirkung von RAD-51 auf die Fluoreszenzspektren zu testen, fügen Sie RAD-51 mit einer Endkonzentration von 1,5 Mikromolen hinzu. Und die Mischung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.
Notieren Sie schließlich die Fluoreszenzspektren von 500 bis 600 Nanometer bei Anregung bei 493 Nanometern. Die maximale FRET-Effizienz wird durch Messung der maximalen Reduktion der Fluoreszenzintensität erreicht, wenn alle einsträngigen DNA-Substrate im Pairing-Assay in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Oder durch Messung der maximalen Erhöhung der Intensität, wenn alle doppelsträngigen DNA-Substrat in einsträngige DNA im Verschiebungstest umgewandelt werden.
In beiden Assays hatte die Zugabe von RAD-51-Protein keinen Einfluss auf die Fluoreszenzemission von FAM oder seine Abschreckwirkungseffizienz durch Gesteine. Die Auswirkungen der spontanen Reaktionen zwischen Substrat-DNAs und der anschließenden Photobleichung sind gering. Wie die vernachlässigbaren Veränderungen der Emission von FAM ohne RAD-51 zeigen, im Vergleich zu den wesentlichen Veränderungen, die mit RAD-51 beobachtet wurden.
Das Hinzufügen des SWI5-SFR1-Komplexes stimuliert stark die Kopplungsaktivität von RAD-51. Die Kopplungsreaktion wird mit einem dreistufigen Modell simuliert, das aus der Bildung des ersten dreistrangigen Zwischenprodukts, dem Übergang in das zweite Zwischenprodukt und der Freisetzung der einsträngigen DNA und der Bildung des Hetero-Duplex besteht. Ein Vergleich des dreistufigen Modells mit einem zweistufigen Modell zeigt, dass das dreistufige Modell besser für die Simulation der DNA-Kopplung geeignet ist, ohne oder mit dem SWI5-SFR1-Komplex.
Die berechnete Gleichgewichtskonstante jedes Reaktionsschritts mit oder ohne SWI5-SFR1 zeigt, dass der SWI5-SFR1-Komplex nicht die Bildung des ersten dreisträngigen Zwischenprodukts stimuliert, sondern den Übergang zwischen den beiden dreistrangigen Zwischenprodukten und die Freisetzung von SS-DNA stark stimuliert. Es ist wichtig zu überprüfen, ob jede Charge gereinigten Proteins frei von Nuklease- und Helicasekontamination ist.
