Die D-Loop-Capture- und Extension-Assays sind die ersten, die eine unvoreingenommene und direkte Quantifizierung der D-Loop-Formations- und Extensionsschritte während der homologen Rekombination in mitotisch wachsenden Hefezellen ermöglichen. Diese lebensfähigkeitsunabhängige Technik ermöglicht die Untersuchung von Proteinen im D-Loop-Stoffwechsel, die sonst nicht von späteren Rollen gelöst werden könnten, wenn man nur BIR-Produkte betrachtet. In Zukunft stellen wir uns vor, diese Assays auf menschliche Zellen zu übertragen, um die Rolle von Schlüsselproteinen, einschließlich BRCA2 und den Bloom- und Warner-Kilo-Fällen bei der homologen Rekombination, besser zu verstehen.
Beginnen Sie mit dem Zentrifugieren der Proben für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Milliliter 1x Psoralenlösung und geben Sie es in eine 60 x 15 Millimeter große Petrischale. Für keine Vernetzungskontrolle resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Milliliter TE1-Lösung.
Als nächstes stellen Sie die UV-Lichtquelle oben im Orbitalschüttler ein, eingestellt auf 50 U/min. Zur Vernetzung der Proben mittels eines UV-Vernetzers mit 365 Nanometer langen Wellenlampen. Positionieren Sie die Petrischalen ein bis zwei Zentimeter unter der UV-Lichtquelle für 10 Minuten mit leichtem Schütteln auf einer vorgekühlten Kunststoff- oder Plexiglasplatte.
Anschließend wird die Probe in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Spülen Sie die Petrischale mit 2,5 Milliliter TE1-Lösung aus und geben Sie diese in die Röhre. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang.
Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius. Legen Sie die Proben zum Auftauen auf Eis. Gleichzeitig ein trockenes Bad auf 30 Grad Celsius vorheizen.
Resuspendieren Sie die Proben in einem Milliliter Sphäroplastenpuffer und überführen Sie sie in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann fügen Sie 3,5 Mikroliter Zymolyaselösung hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Anklopfen. Bei 30 Grad Celsius 15 Minuten inkubieren.
Und dann legen Sie die Schläuche auf Eis. Drei Minuten zentrifugieren und die Proben auf Eis legen. Waschen Sie die Proben dreimal in einem Milliliter Sphäroplastierpuffer und zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang.
Resuspendieren Sie die Proben in einem Milliliter Kälterestriktionsenzympuffer. Drei Minuten zentrifugieren und die Proben auf Eis legen. Wiederholen Sie die Wäsche einmal.
Resuspendieren Sie die Proben in einem Milliliter kaltem 1x-Restriktionsenzympuffer. Teilen Sie die Stichprobe gleichmäßig in zwei Teile auf. Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius.
Resuspendieren Sie ein Röhrchen aus jeder Probe in 180 Mikrolitern 1,4x Restriktionsenzympuffer mit hybridisierenden Oligos und ein weiteres Röhrchen in 180 Mikrolitern 1,4x Restriktionsenzympuffer ohne hybridisierende Oligos. Die Proben in flüssigem Stickstoff einfrieren. Die Proben auf Eis auftauen.
Ein trockenes Bad auf 65 und ein weiteres auf 37 Grad Celsius vorheizen. Aliquot 36 Mikroliter der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und vier Mikroliter 1% SDS und durch vorsichtiges Klopfen an der Seite des Röhrchens gemischt. Bei 65 Grad Celsius 15 Minuten lang mit leichtem Klopfen alle fünf Minuten inkubieren.
Legen Sie die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis. Fügen Sie 4,5 Mikroliter 10% Triton X-100 hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie jeder Probe 20 bis 50 Einheiten High-Fidelity-Enzym EcoR1 oder HindIII hinzu.
Und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit sanftem Rühren alle 20 bis 30 Minuten inkubieren. In dieser Zeit wird das Trockenbad auf 55 Grad Celsius und ein Wasserbad auf 16 Grad Celsius vorgeheizt. Fügen Sie jeder Probe 8,6 Mikroliter 10% SDS hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren und Klopfen.
Bei 55 Grad Celsius 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie 80 Mikroliter 10% Triton X-100 zu jeder Probe hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie 660 Mikroliter 1x Ligationspuffer ohne ATP, ein Millimolares ATP bei pH 8,0 und acht Einheiten T4-DNA-Ligase zu jeder Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Inversion.
Inkubieren Sie 16 Grad Celsius für 1,5 Stunden mit einer Inversion alle 30 Minuten. Legen Sie die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis. Nach der DNA-Aufreinigung, wie im Protokoll beschrieben, verwenden Sie zwei Mikroliter gereinigte DNA, um eine 20-Mikroliter-qPCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers einzurichten.
Richten Sie für jede Probe fünf Kontrollreaktionen und eine Quantifizierungsreaktion ein und führen Sie sie in doppelter Ausführung durch. Die DLC-Assay-Analyse zwei Stunden nach dem doppelsträngigen Bruch oder der DSB-Induktion zeigte, dass die Psoralenvernetzung kritisch ist und die Effizienz von der Zeit zwischen Probenentnahme und qPCR abhängt. Die ARG4-Cp-Werte waren zwischen den vernetzten Proben ähnlich, aber niedriger für die nicht vernetzte Probe, da DNA ohne Vernetzungen effizienter amplifiziert.
Bei allen Proben lag die intermolekulare Ligationskontrolle qPCR im Bereich. Eine robuste DSB-Induktion wurde durch ein niedriges qPCR-Signal für die Kontrolle nachgewiesen, das sich über die HO-Endonuklease-Erkennungsstelle verstärkt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die EcoR1 qPCR-Kontrolle beobachtet.
Das DLC-Signal mit hybridisierendem Oligo wurde durch Normalisierung auf die intermolekulare Ligationskontrolle berechnet. Die DLE-Assay-Analyse, die sechs Stunden nach der DSB-Induktion durchgeführt wurde, zeigte, dass die ARG4-CP-Werte zwischen der mit und ohne hybridisierenden Oligoprobe ähnlich waren. Die intermolekulare Ligations-qPCR-Kontrolle zeigte ein akzeptables Signal für die mit und ohne hybridisierende Oligoprobe, aber ein geringeres Signal für die fehlgeschlagene Probe.
In allen drei Proben gab es eine robuste DSB-Induktion. Da die HindIII-Spaltung von der Restriktionsenzymstelle abhängt, ist die Wiederherstellung der Enzymstelle durch den hybridisierenden Oligo abhängig. Es gab einen signifikanten Unterschied in der Amplifikation über die HindIII-Spaltstelle auf dem resezierten Strang zwischen der Breite und ohne Oligoproben.
Ein geringerer Unterschied in der Amplifikation über die Stelle auf dem verlängerten Strang wurde beobachtet, da hier auch die HindIII-Spaltung von der Ausdehnung abhängt. Die Proben und der Puffer müssen jederzeit kalt gehalten werden. Die Proben müssen nach Resuspension in einem 1,4-fachen Kälterestriktionsenzympuffer mit oder ohne hybridisierende Oligos schockgefroren werden.
Die nachgeschalteten Auswirkungen der D-Loop-Bildung und -Erweiterung auf die Produktbildung können mit Southern Blotting oder genetischen Endpunktassays untersucht werden. Effekte auf die Homologiesuche können mit hoher CP untersucht werden. Die Chromatin-Immunpräzipitation kann Aufschluss über die Rekrutierung eines interessierenden Proteins geben.
