Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Pilz- und Pflanzenmaterialien für Festkörper-Kernspinresonanz oder NMR und dynamische Kernpolarisation (DNP) experimentefür komplexe Biosystemcharakterisierung vorzubereiten. Diese Technik ermöglicht es uns, Biomaterialien auf einer atomaren Auflösungsebene in ihrer heimischen Umgebung zu untersuchen, zum Beispiel in ganzen Zellen. Der Erwerb von hochauflösenden Strukturinformationen über Pilzmaterialien wird bei der Entwicklung von Antimykotika helfen.
Die Methode bietet Einblick in Zusammensetzung und Struktur komplexer Kohlenhydrate in Pilzzellwänden und kann auf viele kohlenhydratreiche Organismen angewendet werden, darunter Pflanzen, Pilze, Algen und Bakterien. Einige Forscher können mit Pilzkontamination in ihren zellulären Kulturen zu kämpfen. Mein Rat ist, das Medium und die Ausrüstung vor dem Gebrauch gründlich zu sterilisieren, um diese Kontamination zu verhindern.
Diese Demonstration wird Forschern mit wenig Erfahrung in NMR oder Zellkultur helfen, zu lernen, wie diese Techniken in Pilz- und Pflanzensystemen implementiert werden. Um unbeschriftetes flüssiges Wachstumsmedium vorzubereiten, lösen Sie 6,5 Gramm Hefeextrakt Pepton-Dextrose oder YPD-Pulver in 100 Milliliter destilliertem Wasser auf und autoklavieren Sie dann die resultierende Lösung für 25 Minuten bei 134 Grad Celsius. Um unbeschriftetes festes Wachstumsmedium vorzubereiten, fügen Sie 6,5 Gramm YPD-Agarpulver zu 100 Milliliter destilliertem Wasser hinzu und autoklavieren Sie das Medium 25 Minuten lang bei 121 Grad Celsius, bevor Sie das Medium auf etwa 50 Grad Celsius abkühlen.
Dann 13 bis 15 Milliliter des geschmolzenen festgewachsenen Mediums in einzelne sterile Kunststoff-Petrischalen geben und sofort die Deckel auf das Geschirr legen. Um Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markiertes flüssiges Wachstumsmedium vorzubereiten, stellen Sie ein 100-Milliliter-Volumen des isotophaltigen Minimalmediums auf einen pH-Wert von 6,6 mit Säure oder Base bei Bedarf ein. Als nächstes lösen Sie die in der Tabelle aufgeführten Salze in 100 Milliliter destilliertem Wasser auf, fügen Sie dem Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markierten flüssigen Wachstumsmedium, und autoklavieren Sie die resultierende Lösung für 25 Minuten bei 121 Grad Celsius.
Wenn die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, fügen Sie 100 Mikroliter Spurenelemente Lösung auf das gesamte Volumen von Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markierte mandmittel. Um die Pilzmaterialien anzubauen, verwenden Sie eine Impfschleife, um eine kleine Menge Pilze aus der Lagerung auf eine YPD-Platte zu übertragen, und kultivieren Sie den Pilz für zwei Tage in einem 30-Grad-Celsius-Inkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine neue Impfschleife, um eine aktive wachsende Pilzkante auf das Kohlenstoff-13-, Stickstoff-15-markierte flüssige Wachstumsmedium zu übertragen, und platzieren Sie die Kultur drei bis fünf Tage lang bei 30 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute in einem Schüttelinkubator.
Wenn große Mengen des Pilzes den Kolbenboden bedecken und in der Flüssigkeit schwimmen, die Pilze durch Zentrifugation sammeln und den Überstand entsorgen. Hydratisieren Sie das Pellet mit einer geeigneten Lösung, und verwenden Sie Zangen, um etwa 0,5 Gramm des gut hydratisierten Pellets für NMR- und DNP-Analysen zu sammeln. Dann mischen Sie das restliche Material mit einer 20%glyzerinLösung in einem konischen Rohr, und legen Sie die Pilzprobe bei minus 80 Grad Celsius für die langfristige Lagerung.
Um den A.fumigatus für die Festkörper-NMR-Analyse vorzubereiten, verwenden Sie zunächst einen Dialysebeutel mit einem 3,5-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff, um die 0,5-Gramm-Kohlenstoff-13, Stickstoff-15-beschriftete Pilzprobe gegen einen Liter 10-Millimolar-Phosphatpuffer bei vier Grad Celsius drei Tage lang zu dialysieren, um kleine Moleküle aus dem Wachstumsmedium zu entfernen. Am Ende der Dialyse die Probe zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr geben und 70 bis 80 Milligramm der gleichmäßig kohlenstoff-13-markierten und gut hydratisierten Probenpaste in einen Vier-Millimeter-Zirkondioxidrotor packen. Verwenden Sie eine Metallstange, um die Probe sanft und wiederholt zu drücken, indem Sie Papier verwenden, um das überschüssige Wasser zu absorbieren.
Dann den Rotor fest verschließen und die Probe in das Spektrometer für die Charakterisierung des Festkörper-NMR einfügen. Um den A.fumigatus für die DNP-Analyse vorzubereiten, fügen Sie 100 Mikroliter DNP-Matrix in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr pro Kohlenstoff-13, Kohlenstoff-15-beschriftete Pilzprobe, und lösen Sie 0,7 Milligramm Polarisationsmittel in jedes Rohr, um eine 10-Millimolar-Radikal-Stammlösung zu bilden. Nach zwei bis drei Minuten Wirbel, um sicherzustellen, dass die Radikale vollständig in der Lösung gelöst werden, tränken Sie 10 Milligramm dialysierte kohlenstoff-13, Stickstoff-15-markierte Pilzprobe in 50 Mikroliter der Polarisationsmittellösung, und verwenden Sie einen Stößel und einen Mörtel, um das Gemisch mild zu mahlen, um das Eindringen der Radikale in die porösen Zellwände zu gewährleisten.
Fügen Sie dem gemahlenen Pellet weitere 30 Mikroliter der Radikallösung hinzu, um die Pilzprobe weiter zu hydratisieren, und packen Sie das Pellet in einen 3,2-Millimeter-Saphirrotor. Drücken Sie leicht und entfernen Sie das überschüssige DNP-Lösungsmittel, wie gezeigt, und fügen Sie einen 3,2-Millimeter-Silikonstecker hinzu, um den Verlust der Hydratation zu verhindern. Fügen Sie dann den Rotor zu einem NMR-Spektrometer für Routineexperimente oder einem DNP-Spektrometer zur Messung des DNP-verstärkten Spektrums unter Mikrowellenbestrahlung hinzu.
Um Pflanzenmaterialien für DNP-Studien vorzubereiten, schneiden Sie das gleichmäßig kohlenstoff-13-markierte Pflanzenmaterial mit einer Rasierklinge in Ein- bis Zweimillimeterstücke. Verwenden Sie einen Mörtel und Stößel, um die Stücke zu kleineren Partikeln zu mahlen, bis das endgültige Pulver ein homogenes Aussehen hat. 40 Mikroliter 10-Millimolar-Radikalstoff-Stammlösung in das Pflanzenmaterial geben und die Probe zusätzlich fünf Minuten leicht mahlen, um eine homogene Vermischung mit dem Radikal zu gewährleisten.
Hydratisieren Sie die Bodenprobe mit weiteren 20 Mikrolitern radikaler Stammlösung, und verpacken Sie die ausgelagerte Pflanzenprobe in einen 3,2-Millimeter-Saphirrotor für die DNP-Analyse. Legen Sie dann einen Silikonstecker ein, um den Verlust der Hydratation zu vermeiden, und laden Sie die Probe auf das DNP-Spektralphotometer. Die Isotop-Etikettierung erhöht die NMR-Empfindlichkeit erheblich und ermöglicht die Messung einer Reihe von zweidimensionalen Kohlenstoff-13-Kohlenstoff-13- und Kohlenstoff-13-Stickstoff-15-Korrelationsspektren, um die Zusammensetzung, Hydratation, Mobilität und Verpackung der Polymere für ihre Integration für die Konstruktion eines dreidimensionalen Modells der Zellwandarchitektur zu analysieren.
Wenn off-diagonale Signale im 2D-Kohlenstoff-13-Kohlenstoff-13-Spektrum schwer zu erhalten sind, könnte eine statistische Kennzeichnung stattgefunden haben. Die beiden Kohlenstoff-13-Spitzen mit 96 und 92 Teilen pro Million sind Signatur-Kohlenstoff-1-Signale von Glukose. Daher deuten ihre starken Intensitäten in den quantitativen Kohlenstoff-13-Spektren der direkten Polarisation, die mit langen Recyclingverzögerungen von 35 Sekunden gemessen werden, typischerweise auf die Dominanz kleiner Moleküle aufgrund unvollständiger Dialyse oder Waschen hin.
Mit gut markierten Proben können weiträumige Korrelationen weiter vermessen werden, um die räumlichen Wahrscheinlichkeiten von Biomolekülen zu erkennen und ein Strukturmodell der intakten Zellwände zu konstruieren. Diese Technik ermöglicht die Erforschung der Strukturfunktion in vielen natürlich vorkommenden und technischen Materialien, was zukünftige Studien zu kohlenhydratreichen Biomaterialien und funktionalisierten Polymeren ermöglicht. Da einige Pilze Infektionen oder systematische Krankheiten beim Menschen verursachen können, achten Sie darauf, Pilzmaterialien in einer laminaren Strömungshaube zum Schutz und zur Minimierung der Exposition zu behandeln.
