Bu protokol katı hal nükleer manyetik rezonans, veya NMR ve dinamik nükleer polarizasyon, ya da DNP, karmaşık biyosistem karakterizasyonu için deneyler için mantar ve bitki malzemeleri hazırlamak için kullanılabilir. Bu teknik, biyomateryalleri ana ortamlarında, örneğin tüm hücrelerde atomik çözünürlük düzeyine kadar araştırmamıza olanak sağlar. Mantar malzemeleri hakkında yüksek çözünürlüklü yapısal bilgilerin edinimi antifungal ilaçların geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
Yöntem, mantar hücre duvarlarındaki kompleks karbonhidratların bileşimi ve yapısı hakkında bilgi sağlar ve bitkiler, mantarlar, yosunlar ve bakteriler de dahil olmak üzere birçok karbonhidrat açısından zengin organizmaya uygulanabilir. Bazı araştırmacılar kendi hücresel kültürlerde mantar kontaminasyonu ile mücadele edebilir. Benim tavsiyem bu kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce orta ve ekipman iyice sterilize etmektir.
Bu gösteri, NMR veya hücre kültüründe çok az deneyime sahip araştırmacıların bu teknikleri mantar ve bitki sistemlerinde nasıl uygulayacaklarını öğrenmelerine yardımcı olacaktır. Etiketsiz sıvı büyüme ortamı hazırlamak için, 6,5 gram maya özü peptone dekstroz veya YPD tozunu 100 mililitre distile suda çözün ve elde edilen çözeltiyi 134 santigrat derecede 25 dakika otoklavlayın. Etiketsiz katı büyüme ortamı hazırlamak için, 100 mililitre distile suya 6,5 gram YPD agar tozu ekleyin ve ortayı yaklaşık 50 santigrat dereceye kadar soğutmadan önce 121 santigrat derecede 25 dakika otoklavlayın.
Daha sonra, eritilmiş katı büyüme ortamının 13 ila 15 mililitresini tek tek steril plastik Petri kaplarına aktarın ve kapakları hemen tabakların üzerine yerleştirin. Karbon-13, azot-15 etiketli sıvı büyüme ortamı hazırlamak için, gerektiğinde asit veya baz ile 6,6 pH'a kadar izotop içeren 100 mililitrelik bir izotop hacmini ayarlayın. Daha sonra, distile su 100 mililitre tabloda listelenen tuzları eritin, karbon-13, azot-15 etiketli sıvı büyüme ortamı ekleyin ve 121 santigrat derece 25 dakika için ortaya çıkan çözelti autoclave.
Çözelti oda sıcaklığına soğuduğunda, karbon-13, azot-15 etiketli minimum ortam tüm hacmine 100 mikrolitre eser element çözeltisi ekleyin. Mantar malzemelerini yetiştirmek için, depolamadan küçük miktarda mantarı YPD plakasına aktarmak için aşılayıcı bir döngü kullanın ve mantarı 30 derecelik bir kuluçka makinesinde iki gün boyunca kültüre aktarın. Kuluçka sonunda, aktif büyüyen bir mantar kenarını karbon-13'e, azot-15 etiketli sıvı büyüme ortamına aktarmak için yeni bir aşılama döngüsü kullanın ve kültürü sallayarak bir kuluçka makinesinde üç ila beş gün boyunca dakikada 30 santigrat derece ve 220 dönüşe yerleştirin.
Mantar büyük miktarlarda şişe alt kapak ve sıvı içinde yüzen, santrifüj ile mantar toplamak ve supernatant atın. Peleti uygun bir çözeltiyle nemlendirin ve NMR ve DNP analizleri için yaklaşık 0,5 gram iyi sulu pelet toplamak için forseps kullanın. Daha sonra, konik bir tüp te %20 gliserol çözeltisi ile kalan malzemeyi karıştırın ve mantar örneğini uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede yerleştirin.
Katı hal NMR analizi için A.fumigatus hazırlamak için, ilk olarak 0.5-gram karbon-13 diyaliz 3.5-kilodalton moleküler ağırlık kesme ile bir diyaliz torbası kullanmak, azot etiketli mantar örneği bir litre karşı 10-milimolar fosfat tampon dört derece santigrat üç gün boyunca büyüme ortamı küçük molekülleri kaldırmak için. Diyaliz sonunda, santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp içine örnek aktarın ve dört milimetrezirkonyum dioksit rotor içine düzgün karbon-13 etiketli ve iyi sulu örnek macun 70 ila 80 miligram paketi. Aşırı suyu emmek için kağıt kullanarak numuneyi hafifçe ve tekrartekrar sıkmak için metal bir çubuk kullanın.
Daha sonra, rotorsıkıca kapve katı hal NMR karakterizasyonu için spektrometre içine örnek ekleyin. A.fumigatus'u DNP analizi için hazırlamak için, karbon-13 başına 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 100 mikrolitre DNP matrisi ekleyin, karbon-15 etiketli mantar numunesi ve 10 milimolar radikal stok çözeltisi oluşturmak için her tüpe 0,7 miligram polarize etkeni çözün. Radikallerin çözeltide tamamen çözünmesini sağlamak için iki ila üç dakika girdap yaptıktan sonra, 10 miligram arabozkarbon-13, polarize ajan çözeltisinin 50 mikrolitresinde azot-15 etiketli mantar numunesi ıslatın ve radikallerin gözenekli hücre duvarlarına nüfuz etmesini sağlamak için karışımı hafifçe öğütmek için bir havaneli ve harç kullanın.
Mantar örneğini daha fazla nemlendirmek için zemin peletine 30 mikrolitre daha radikal çözelti ekleyin ve peleti 3,2 milimetrelik safir rotora sığdırın. Hafifçe sıkın ve gösterildiği gibi aşırı DNP çözücü kaldırın ve hidrasyon kaybını önlemek için 3.2 milimetrelik silikon fişi ekleyin. Daha sonra, rotoru rutin deney için bir NMR spektrometresine veya mikrodalga ışınlama altında DNP ile geliştirilmiş spektrumun ölçümü için bir DNP spektrometresine ekleyin.
DNP çalışmaları için tesis malzemeleri hazırlamak için, düzgün karbon-13 etiketli bitki malzemesini bir ila iki milimetrelik parçalarhalinde kesmek için bir jilet kullanın. Son toz homojen bir görünüme sahip olana kadar küçük parçacıklar halinde parçaları öğütmek için bir harç ve havaneli kullanın. Bitki materyaline 40 mikrolitre 10 milimolar radikal stok çözeltisi ekleyin ve radikal ile homojen karıştırma sağlamak için numuneyi beş dakika daha hafifçe öğütün.
Zemin örneğini 20 mikrolitre daha radikal stok çözeltisi ile nemlendirin ve dnp analizi için dengelenmiş bitki örneğini 3,2 milimetrelik safir rotora sığdırın. Ardından, hidrasyon kaybını önlemek için silikon fişi takın ve numuneyi DNP spektrofotometresine yükleyin. İzotop etiketleme önemli ölçüde NMR duyarlılığını artırır ve iki boyutlu karbon-13-karbon-13 ve karbon-13-azot-15 korelasyon spektrumları bir dizi ölçmek için mümkün hale getirir kompozisyon analiz etmek, hidrasyon, hareketlilik, ve hücre duvarı mimarisinin üç boyutlu bir model ininşaat için polimerlerin entegrasyonu için polimerlerin ambalaj.
2B karbon-13-karbon-13 spektrumunda çapraz dışı sinyallerin elde edilmesi zorsa, istatistiksel etiketleme meydana gelmiş olabilir. İki karbon-13 zirvesi 96 ve milyonda 92 parça glikoz imzası karbon-1 sinyalleri vardır. Bu nedenle, 35 saniye uzun geri dönüşüm gecikmeleri ile ölçülen kantitatif karbon-13 doğrudan polarizasyon spektrumlarındaki güçlü yoğunlukları genellikle eksik diyaliz veya yıkama nedeniyle küçük moleküllerin hakimiyetini gösterir.
İyi etiketlenmiş numunelerle, biyomoleküllerin mekansal yakınlıklarını tespit etmek ve bozulmamış hücre duvarlarının yapısal bir modelini oluşturmak için uzun menzilli korelasyonlar daha da ölçülebilir. Bu teknik, karbonhidrat açısından zengin biyomalzemeler ve işlevsel polimerler üzerinde gelecekteki çalışmaları kolaylaştırarak, birçok doğal olarak meydana gelen ve tasarlanmış malzemelerin yapı işlevinin araştırılmasını sağlar. Bazı mantarlar insanlarda enfeksiyona veya sistematik hastalıklara neden olabileceğinden, mantar malzemelerini korunmak ve maruziyeti en aza indirmek için laminar akış kaputunda ele aldığından emin olun.
