Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Benutzern ermöglicht, Mitochondrienproben aus gefrorenem Gewebe vorzubereiten, die aus früheren Studien gesammelt und archiviert wurden. Dieses Protokoll reduziert auch die Verwendung von lebenden Tieren für die Gewebeentnahme. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, zuvor gefrorenes Archivgewebe zu verwenden, um mit Mitochondrien angereicherte Proben durch eine sanfte Gewebezerkleinerungsmethode vorzubereiten.
Diese Zubereitungsmethode maximiert die Ausbeute der Mitochondrienpräparation. Durch das Lesen des Protokolls ist es ratsam, die Verfügbarkeit aller Komponenten und Werkzeuge, insbesondere des voll aufgeladenen Aktenvernichterantriebs, sicherzustellen und auch mit einigen unerwünschten Taschentüchern zu trainieren, um sich mit den Schritten vertraut zu machen. Das Verfahren wird Edina Kosa, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren.
Notieren Sie zunächst das Gewicht der Röhre, die das Herzgewebe enthält. Wiegen Sie nun den leeren Schlauch und subtrahieren Sie ihn vom zuvor aufgezeichneten Gewicht, um ein Nettogewicht des Herzgewebes zu erhalten. Geben Sie das gefrorene Herzgewebe direkt in das Becherglas der eiskalten Lösung.
Rühren Sie es für fünf Minuten. Gleichzeitig wird mit einer Pinzette ein leichter Druck auf das Gewebe ausgeübt, um so viel Blut wie möglich herauszuholen. Nehmen Sie das Gewebe mit einer Pinzette heraus und drücken Sie das Herz mit einem sauberen Filterpapiertuch zusammen, um Blut zu entfernen.
Dann legen Sie das Gewebe in einen anderen Becher mit eiskalter Lösung. Nachdem Sie das Gewebe fünf Minuten lang umgerührt haben, trocknen Sie das Gewebe vorsichtig auf einem Papiertuch und entfernen Sie das Fett, geronnene Blut, Ohrmuscheln und Faszien. Poolen Sie das ventrikuläre Gewebe.
Um die Gewebeproben zu zerkleinern, legen Sie 50 bis 300 Milligramm Herzgewebe von der Widderseite in die Gewebezerkleinerkammer und schließen Sie die Widderseite. Dann etwa 0,2 bis 0,8 Milliliter Waschpuffer auf die Kappenseite des Röhrchens geben. Verwenden Sie das Rohrwerkzeug, um die Shredderkammer mit der Shredderkappe fest zu verschließen, ohne sie zu fest anzuziehen.
Legen Sie die Zerkleinererkammer mit der Stößelseite nach unten in die Zerkleinerereinheit, um die Montage zu aktivieren. Setzen Sie das Bit des voll aufgeladenen Aktenvernichterfahrers ein und aktivieren Sie es mit der Zerkleinererkappe, um sicherzustellen, dass das Bit fest eingerastet ist, und üben Sie dann Druck auf den Zerkleinerertreiber in der Zerkleinererkammer aus, bis die Druckanzeige am Aktenvernichterhalter eine Einstellung von ungefähr zwei erreicht. Drücken Sie den Auslöser und lassen Sie den Aktenvernichtertreiber etwa 10 bis 12 Sekunden lang laufen, während Sie die Einstellung bei zwei halten.
Beobachten Sie das Röhrchen, um das Zerkleinern sicherzustellen und die gesamte oder den größten Teil der Gewebemasse durch die Lysescheibe in die obere Shredderkammer zu leiten, und geben Sie das Röhrchen gegebenenfalls zum Zerkleinererhalter zurück, um das Zerkleinern fortzusetzen. Heben Sie nach dem Zerkleinern der Probe die Zerkleinerungskammer aus der Haltereinheit heraus und verwenden Sie das Röhrchenwerkzeug, um die Zerkleinererkappe zu entfernen und auf eine saubere Oberfläche für die spätere Verwendung zu legen, die nur innerhalb derselben Probe empfohlen wird, um eine Kreuzkontamination durch andere Gewebeproben zu vermeiden. Das zerkleinerte Herzgewebe mit 40 Millilitern Waschpuffer mit einem Rührstab in das dritte Becherglas geben und das Gewebe fünf Minuten lang mit mittlerer Geschwindigkeit auf der Rührplatte umrühren.
Filtern Sie die Suspension durch ein vorbenetztes Nylon-Mesh-Monofilament. Nach dem Entsorgen des Filtrats waschen Sie das zerkleinerte Gewebe auf dem Filter dreimal mit 10 Millilitern Waschpuffer. Das gewaschene Gewebe in ein 50 MilliliterBecherglas mit 20 Milliliter Waschpuffer geben, der im Eisbad auf der Magnetwühlung platziert wird.
Fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsinlösung hinzu, während Sie 15 Minuten lang ständig umrühren. Etwa nach der Hälfte des Rührens wird die Gewebesuspension in einen locker sitzenden Hand-Glas-auf-Glas-Homogenisator überführt, der 15 Milliliter Volumen aufnehmen kann. Homogenisieren Sie die Suspension mit vier bis fünf sanften Schlägen, ohne Schaum zu erzeugen.
Dann das Homogenat in ein 50 Milliliter Becherglas geben und auf einer Rührplatte mischen. Als nächstes werden 10 Milliliter des Trypsinininhibitors enthaltenden Isolationspuffers in das Homogenat gegeben und unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Nach dem erneuten Filtern der Suspension durch einen Nylonfilter bewahren Sie den Filter in einem 50 Milliliter konischen Rohr auf und übertragen die auf dem Filter verbleibende Partikelfraktion auf den Glas-auf-Glas-Homogenisator.
Bei 15 bis 20 Millilitern des Waschpuffers und vorsichtig mit der Hand für 25 bis 30 Sekunden homogenisieren. Nachdem Sie das Homogenat mit dem Filtrat kombiniert und die Röhrchen ausbalanciert haben, zentrifugieren und dann mit einer Kunststoffpipette den Überstand entfernen und 0,2 Milliliter von der Oberseite des flauschigen Pellets zurücklassen. Filtern Sie den resultierenden Überstand mit einem Nylonfilter in ein neues konisches Rohr, um eine Kontamination zu vermeiden, und zentrifugieren Sie ihn noch einmal.
Nach dem Entsorgen des Überstands waschen Sie das Pellet zwei- bis dreimal, indem Sie den Isolationspuffer an der Seite des Rohres hinzufügen, um ein Brechen oder Kontaminieren des Pellets zu verhindern. Verwerfen Sie die flauschige weiße äußere Randschicht jedes Mal. Fügen Sie fünf Milliliter des Isolationspuffers zu jedem Rohr hinzu und brechen Sie das Pellet mit einer Pipette mit einer Ein-Milliliter-Spitze oder einer neuen Transferpipette auf Dann verdünnen Sie die Suspension mit 20 Millilitern zusätzlichem Isolationspuffer und zentrifugieren Sie die Suspension bei 8.500 X g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspenieren Sie das Pellet zunächst in fünf Milliliter und dann in weiteren 15 Millilitern des Wiederverwendungspuffers und der Zentrifuge bei 8.500 X g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie nun den Überstand und bewahren Sie das braune Pellet auf, das gewaschene intakte Mitochondrien enthält. Resuspend das mit Mitochondrien angereicherte Pellet in 250 Mikroliter des resuspending Puffers einschließlich Proteasehemmer.
Aliquot die Suspension in 25 Mikroliter Volumen, schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und in einem 80 Grad Celsius Tiefkühlschrank für mehrere Jahre lagern. Nach dem Protokoll wurde das mit Mitochondrien angereicherte Protein aus dem Herzen der Nachkommen hergestellt, die von zwei Gruppen von Sauen geboren wurden. Einer wurde während der Schwangerschaft trainiert und der andere war sesshaft.
Die ETC-Proteinprofilanalyse ergab, dass die Nachkommen von trainierten Sauen in einigen der ETC-Komplexe relativ reduzierte Werte aufwiesen. Mitochondriale Proteine wurden in einem 3 bis 8%igen Gradienten BN-PAGE aufgelöst und mit Antikörpercocktails immungesondert. Sowohl trainierte als auch sitzende Gruppen weisen mehrere Superkomplexe auf.
Der beobachtete prominente Anstieg des Superkomplexes lag in der trainierten Gruppe bei neun Monaten im Vergleich zur sitzenden Gruppe. Mitochondrien angereicherte Proteine, die aus verschiedenen Altersgruppen von 48 Stunden, drei Monaten, sechs Monaten und neun Monaten gewonnen wurden, wurden mit einem kinetischen Assay auf die Complex I-II-Aktivität analysiert. Die trainierte Gruppe zeigte eine komplexe I-II-Aktivität im Vergleich zu der der sitzenden Gruppe.
Die Machbarkeit funktioneller Studien an Mitochondrien, die aus gefrorenen Geweben und Zellen gewonnen werden, wird von anderen Forschern gezeigt. Die Herstellung von Mitochondrien, die aus gefrorenem Gewebe gewonnen werden, kann für eine Vielzahl von Geweben mit minimaler Schädigung angewendet werden.
