Dieses Protokoll ist wichtig, weil das Vorhandensein von Krebsstammzellen mit einem Rückfall oder einem schlechten Ergebnis nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht werden kann. Das Studium der radioresistenten Stammzellen kann Hinweise zur Überwindung der Radioresistenz liefern. Bei dieser Technik werden Krebsstammzellen durch Durchflusszytometrie mit vermeintlichen Markern gesalzen und die Selbsterneuerungsfähigkeit von gesalzenen Zellen durch Kugelbildungstest bewertet.
Der Koloniebildungstest wird durchgeführt, um die Radiosensitivität von gesalzenen Zellen zu bewerten. Es bestimmt, wie viele Zellen ihre Fähigkeit verloren haben, die Synthese zu erzeugen, die die Kolonie nach einer bestimmten Dosis Strahlung bilden. Dieses Manuskript enthält die ersten Schritte für die Radiosensitivitätsstudie von Krebsstammzellen, die die Grundlage für eine umfassendere Mechanismusstudie schafft.
Die Mechanismusstudie kann Proteine im Zusammenhang mit der Reparatur von DNA-Schäden, der Clearance von reaktiven Sauerstoffspezies, dem Zellzyklusstillstand usw. umfassen. Es wird wichtige Einblicke geben, wie Krebsstammzellen Radioresistenz erhalten und wie die Resistenz überwunden werden kann. Demonstriert wird das Strahlenverfahren von Chen-Nan Li, einem Strahlentechniker aus unserer Abteilung.
Um dieses Verfahren zu beginnen, Kultur A549 Zellen in RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10%FBS in 10 Zentimeter Geschirr bei 37 Grad Celsius, mit 5%Kohlendioxid. Wenn die Zellen 80 bis 90 % Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen kurz mit drei Millilitern PBS.
Als nächstes fügen Sie drei Milliliter 0,05%Trypsin zu jedem Gericht hinzu. Entfernen Sie das Trypsin und lassen Sie das residuary Trypsin, um die Zellen bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Minuten zu verdauen. Überprüfen Sie häufig die Ablösung der Zellen, um eine Überverdauung zu vermeiden.
Wenn die Zellen locker werden und beginnen, sich von den Gerichten zu lösen, fügen Sie drei Milliliter RPMI-1640 Medium mit 10% FBS ergänzt und übertragen die Zellen Suspension zu einem 50 Milliliter Rohr. Zentrifuge bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter PBS wieder aus.
Übertragen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension als Isotypkontrolle in ein neues Rohr. Zentrifugieren Sie sowohl die Steuer- als auch die Versuchsröhrchen bei 300 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie die Überräube.
Verdünnen Sie dann sowohl die fluoreszierende diconjugierte Isotypkontrolle als auch den Antikörper in PBS auf die optimale Konzentration, die zur Vorbereitung der Arbeitslösung titriert wird. Setzen Sie die Kontroll- und Versuchszellen mit jeder Arbeitslösung aus und mischen Sie sie sanft. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln und bei Raumtemperatur für 30 bis 40 Minuten.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter PBS hinzufügen, sanft mischen und zentrifugieren bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die Zellen mit 10 MilliliterPBS wieder aus. Als nächstes legen Sie 40 Mikrometer Zellsiebe auf neue 50 Milliliter-Röhren, um sicherzustellen, dass ein separates Rohr und Sieb Setup für die Steuer- und Versuchszellen vorbereitet.
Tragen Sie jede Zellsuspension auf das jeweilige Sieb auf und sammeln Sie den Durchfluss. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 0,2 bis 1,0 Milliliter PBS wieder auf und übertragen Sie jede Zellsuspension in eine separate Fünf-Milliliter-Röhre für die Durchflusszytometrie.
Bereiten Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank eine sechs Brunnenplatte für jede Strahlendosis vor, einschließlich der grauen Gruppe Null. Fügen Sie 1,5 Milliliter abgeschlossener 1640 Medien zu jedem Brunnen hinzu. Verdünnung von geernteten Zellen mit abgeschlossenen 1640 Medien auf eine Zelldichte von 1.000 Zellen pro Milliliter.
Dann fügen Sie die verdünnte Zellsuspension in die Brunnen und schütteln Sie die Platten horizontal, um die Zellen in den Brunnen gleichmäßig zu verteilen. Zeichnen Sie das in jeder Dosisgruppe hinzugefügte Volumen auf. Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Nachdem die Zellen an der Unterseite der Brunnen befestigt sind, fügen Sie fertige 1640 Medien zu jedem Brunnen hinzu, bis die Medienhöhe einen Zentimeter erreicht. Wenn die Platten zwischen Zellkulturraum und Strahlentherapieraum übertragen werden, wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie oder legen Sie sie in eine saubere Box, um Verunreinigungen zu vermeiden. Halten Sie die Platten flach, um ein Austreten des Mediums zu vermeiden.
Als nächstes auf 20 Zentimeter mal 20 Zentimeter Strahlungsfeld eingestellt. Legen Sie einen Gewebeäquivalent bolus von 1,0 Zentimeter Dicke auf die Behandlungscouch und legen Sie die sechs Brunnenplatte auf den Bolus, um sie in Kontakt zu halten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Platte innerhalb des Strahlungsfeldes befindet.
Stellen Sie den Quell-Haut-Abstand auf 100 Zentimeter ein, und passen Sie die Höhe der Behandlungscouch an, um die mittlere Oberflächenebene an der Laserebene auszurichten. Geben Sie die zugewiesene Dosis nacheinander an jede Platte weiter. Danach nehmen Sie die Platten zum Biosicherheitsschrank im Zellkulturraum.
Ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch zwei Milliliter abgeschlossen1640 Medium. Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass das Medium alle drei bis fünf Tage zu ändern. Sieben bis zehn Tage nach der Strahlung das Medium entfernen und die Zellen kurz mit PBS waschen.
In einer Dunstabzugshaube, fügen Sie einen Milliliter 4%Formaldehyd zu jedem Brunnen, um die Zellen für 10 Minuten zu fixieren. Dann entfernen Sie das Formaldehyd und waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit zwei Milliliter destilliertem Wasser für jede Wäsche. Fügen Sie einen Milliliter 1%Kristallviolettfleck Lösung zu jedem Brunnen und Fleck für 10 Minuten.
Danach die kristallviolette Fleckenlösung entfernen und die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser waschen. Entfernen Sie das Wasser und lassen Sie die Platten 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien mit mehr als 50 Zellen.
In dieser Studie werden beide Alpha-zwei-Delta-Eins-Hoch- und Alpha-zwei-Delta-Eins-Niedrige A549-Zellen sortiert. Einige Marker können unterschiedliche Populationen aufweisen und sind leicht zu tororieren. Einige Marker weisen jedoch nur hohe und niedrige Ausdrucksmuster auf, anstatt ausgeprägte positive und negative Populationen zu unterscheiden.
In dieser Situation ist eine Isotypkontrolle sehr wichtig für die Gating. Die Expression von alpha zwei Delta eins in sortierten Zellen wird durch qPCR validiert. Die Expression von CACNA2D1, dem Gen, das Alpha zwei Delta eins kodiert, ist höher in sortierten Alpha zwei Delta ein hohe Zellen im Vergleich zu alpha zwei Delta ein niedrige Zellen.
Typische Morphologie von Kugeln und die Sphärenbildungseffizienz wird hier gezeigt. Alpha zwei Delta ein hohe Zellen zeigen eine höhere Kugelbildung Effizienz, was auf eine höhere Selbsterneuerungskapazität. Typische Bilder von Kolonien und Überlebenskurven werden hier gezeigt.
Eine Kolonie mit etwa 50 Zellen kann unter dem Mikroskop untersucht und als Referenz markiert werden. Die Anzahl der Kolonien wird gezählt, dann kann eine Überlebensfraktion bei jeder Dosis berechnet und eine Überlebenskurve dargestellt werden. Alpha zwei Delta ein hohe Zellen sind relativ resistent gegen Strahlung im Vergleich zu Alpha zwei Delta ein niedrige Zellen.
Alle Schritte im Zusammenhang mit der Zellkultur sollten im biologischen Sicherheitsschrank oder laminaren sauberen Bank durchgeführt werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, wird empfohlen, dem Kulturmedium nach dem Sortieren Antibiotika hinzuzufügen. Wenn ein vermeintlicher Krebsstammzellmarker durch den Kugelbildungstest vorläufig identifiziert wird, kann eine weitere Charakterisierung durch in vivo-begrenzenden Verdünnungstest durchgeführt werden, um die tumorgene Kapazität zu bewerten.
Aus der Mechanismusstudie der Radioresistenz können Forscher das Protein untersuchen, das mit der Reparatur von DNA-Schäden, der Clearance von reaktiven Sauerstoffspezies und dem Zellzyklusstillstand als Reaktion auf Strahlung zusammenhängt. Bitte beachten Sie bei der Zellstrahlung, dass der Linearbeschleuniger nur von qualifizierten Technikern betrieben werden kann. Von Strahlung fernhalten.
Beachten Sie im Stehen, dass Formaldehyd flüchtig und gefährlich ist. Verwenden Sie Formaldehyd in der Dunstabzugshaube.
