Dieser DNA-basierte integrative Spannungssensor (ITS), das Kraftsignal lokal in Fluoreszenz umwandelt, ermöglicht die direkte Abbildung der zellulären Kraft mit Fluoreszenzmikroskopie. ITS hat eine hohe räumliche Auflösung und eine hohe Empfindlichkeit. Die Aktivierungsschwelle ist abstimmbar, was ein selektives Bild der Integrinspannung auf verschiedenen Ebenen ermöglicht.
Nach Erhalt der kundenspezifischen einsträngigen DNA oder ssDNA, die von Interesse ist, um RGD-Peptid zum thiolierten ssDNA-Quencher zu konjugieren, fügen Sie zunächst 100 Mikroliter 0,5-molar EDTA in 400 Mikroliter Wasser zu etwa 450 Mikroliterfrisch hergestellter TCEP-Lösung hinzu. Fügen Sie dann 10 Mikroliter der TCEP-EDTA-Lösung zu 20 Mikrolitern einmillimollaren Thiol-DNA-Quencher in PBS für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Um RGD-Amin mit Sulfo-SMCC zu konjugieren, fügen Sie 40 Mikroliter frisch zubereiteten 23-Millimolar-Sulfo-SMCC zu 100 Mikroliterfrisch zubereiteter 11-Millimolar-RGD-Aminlösung für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu.
Um RGD-Amin SMCC mit dem thiolierten ssDNA-Quencher zu konjugieren, mischen Sie das gesamte Volumen der thiolierten ssDNA Quencher-Lösung mit dem gesamten Volumen der RGD-Amin-SMCC-Lösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Lösung am Ende der Inkubation über Nacht auf vier Grad Celsius Lagerung. Am nächsten Morgen dreimolares Natriumchlorid mit der thiolkonjugierten DNA-Lösung und minus 20 Grad Celsius, gekühlt, 100% Ethanol im Verhältnis eins bis 10 bis 25, mischen und die Reaktion etwa 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius platzieren.
Wenn die DNA gefällt hat, sammeln Sie die DNA durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in PBS zur Messung der DNA-Konzentration auf einem Spektrometer wieder auf. Für integrativen Spannungssensor, oder ITS, Synthese, mischen Sie die oberen und unteren Strang DNA-Lösungen in einem 1,1-zu-ein-Molar-Verhältnis, und inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei vier Grad Celsius, bevor Aliquots der Mischung bei minus 20 Grad Celsius für die langfristige Lagerung. Für die ITS-Immobilisierung eine Petrischale mit 29 Millimeterdurchmessern mit Glasboden mit 200 Mikrolitern 0,1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertem Rinderserumalbumin oder BSA-Biotin 30 Minuten bei vier Grad Celsius beschichten.
Wenn das BSA-Biotin auf der Glasoberfläche physisch adsorbiert hat, waschen Sie die Schale dreimal mit 200 Mikrolitern frischer PBS pro Wäsche, gefolgt von einer Inkubation mit 200 Mikrolitern 50 Mikroliter pro Milliliter Avidinprotein 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Schale dreimal mit PBS wie gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter 0,1-Mikromolar ITS für eine weitere 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Schale dreimal mit PBS, so dass die letzte Wäsche in der Schüssel bis zur Zellbeschichtung.
Um eine Fischkeratozytenkultur zu initiieren, verwenden Sie eine flache Pinzette, um ein Stück Skala von einem Fisch zu pflücken, und drücken Sie vorsichtig die Waage auf den Brunnen einer unveränderten Glasboden-Petrischale, wobei die Innenseite der Waage das Glas anbringt. Warten Sie etwa 30 Sekunden, bis die Fischwaage an der Glasoberfläche der Schale haftet, bevor Sie die Waage mit einem Millimeter des modifizierten Dulbecco-Mediums von Iscove bedecken. Dann inkubieren Sie die Waage in einer dunklen und feuchten Box für sechs bis 48 Stunden bei Raumtemperatur.
Um die Keratozyten auf die ITS-Oberfläche zu stellen, ersetzen Sie das Medium aus der Keratozytenkulturschale durch eine 1X-Zellablösung für eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die Ablösungslösung durch ein frisches komplettes Medium, und dissoziieren Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung. Passen Sie dann die Zellen auf die entsprechende Konzentration für die Beschichtung an und säen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf die ITS-beschichtete Schale, bevor Sie sie bildgebungsbilden.
Für quasi-Echtzeit-Integrin-Spannungsbildgebung in lebenden Zellen, übertragen Sie die Zellen auf das Stadium eines Fluoreszenzmikroskops, und wählen Sie das 40- oder 100-fache Objektiv. Legen Sie in der Bildverarbeitungssoftware die Belichtungszeit auf eine Sekunde und das Bildintervall von 20 Sekunden fest, um ein Video der ITS-Bilder zu erhalten. Verwenden Sie dann ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm, um einen vorherigen Frame des ITS-Videos von einem aktuellen Frame zu subtrahieren, um das ITS-Signal zu berechnen, das im neuesten Frameintervall neu erstellt wurde.
Das neu erzeugte ITS-Signal stellt die im letzten Rahmenintervall erzeugte Integrinspannung dar und meldet damit die zelluläre Kraft quasi-echtzeit. Hier zeigt die Integrinspannungskartierung die Induktion von Integrinspannung an zwei Kraftspuren während der Keratozytenmigration. Die Auflösung der Kraftkarte könnte dann auf 0,4 Mikrometer kalibriert werden.
Hohe Integrinspannung konzentriert sich am hinteren Rand in motilen Fischkeratozyten. In nichtmotilen Zellen wird ein spezifisches Integrin-Spannungsmuster gebildet, das sich deutlich von dem unterscheidet, das beim schnell wandernden Keratozyten beobachtet wird. Fokale Adhäsionen und die Integrinspannung von Fischkeratozyten können mitabgebildet werden, um die Beziehung zwischen Integrinspannung und Zellstruktur in Voninteresseszellen zu bewerten.
Mit ITS wird die Zellhaftungskraft mit einer Auflösung und einer Empfindlichkeit sichtbar, die mit der Zellstrukturbildgebung vergleichbar ist. Diese Technik ebnet den Weg für die Untersuchung eines Kraft-Struktur-Zusammenspiels in Zellen.
