Adhärente Zellen üben Kräfte auf ihre Umgebung aus, und diese Kräfte umfassen die Kräfte, die Zellen auf das Substrat ausüben, hier grün dargestellt, und die Kräfte, die Zellen auf ihre Nachbarn ausüben, rot dargestellt. Diese Kräfte können in zellulären Monoschichten mit einer Technik gemessen werden, die als Monoschicht-Spannungsmikroskopie bezeichnet wird. Kurz gesagt, die Technik beinhaltet die Herstellung von Hydrogelen, die winzige fluoreszierende Perlen enthalten, direkt unter der oberen Oberfläche, und große fluoreszierende Perlen, die auf das Glas geklebt werden.
Auf diesem Hydrogel sieht man die Zellen und kultiviert sie zum Zusammenfluss oder in welchem Zustand auch immer man Kräfte messen möchte. Die Messung von Kräften erfordert die Abbildung der zellulären Monoschicht, die Aufnahme von Durchlichtbildern der Zellen und Fluoreszenzlichtbilder der winzigen und großen Perlen. Jedes dieser Bilder wird in der gleichen Stimmebene aufgenommen.
Diese Bilder werden aufgenommen, wenn die Zellen an das Hydrogel gebunden und losgelöst sind. Und ein Vergleich dieser beiden Bildsätze liefert uns die Daten, die notwendig sind, um all diese Kräfte zu quantifizieren. Hier kommen AcTrM und AnViM ins Spiel.
Nachdem Sie die Zellen plattiert haben, um Bilder an genau der gleichen Stelle und an jeder gewünschten Instanz aufzunehmen, wird dieses Protokoll in AcTrM programmiert und anschließend diese Daten analysiert und die Ergebnisse visualisiert, das ist der Zweck von AnViM. In den nächsten Minuten werden wir Sie durch den Prozess der Aufnahme von Bildern für eine Konfluenzzellmonoschicht führen. Aktionsschritt Null fordert den Benutzer auf, den Erfassungstyp auszuwählen.
Eine neue Akquisition, um ein neues Experiment zu starten, oder eine fortgesetzte Akquisition, um ein früheres Experiment fortzusetzen. Klicken Sie auf Fresh Acquisition, um eine Positionsliste zu erstellen. Der erste Aktionsschritt listet alle Nächsten Schritte auf.
Und diese Aktionen werden hier im Fenster der Bühnenpositionsliste ausgeführt. Klicken Sie auf Live in Micro-Manager, um das Beispiel für manuelle Anpassungen zu visualisieren. In der Live-Ansicht werden wir uns die Phase ansehen.
Hier ist es klar. Jetzt muss man sich die Perlen ansehen. Hier können die Kügelchen in Fluoreszenz visualisiert werden.
Wählen Sie also den für die oberen Perlen geeigneten Kanal aus. Es ist auch wichtig, dass Sie in der Lage sind, ein paar untere Perlen zu sehen, also schauen wir uns einen Kanal für die unteren Perlen an. Was Sie hier sehen, ist ein verschwommenes Bild von unteren Perlen, und das ist völlig in Ordnung, solange Sie erkennen können, dass die unteren Perlen da sind, was Sie in diesem Bild können.
Positionsliste, klicken Sie auf Markieren. So erstellen Sie eine Positionsliste. Nachdem Sie eine Positionsliste erstellt haben, die im vorherigen Video besprochen wurde, führen Sie die in Aktionsschritt zwei aufgeführten Schritte mithilfe des mehrdimensionalen Erfassungsfensters aus.
Nehmen wir an, wir wollen einen langen Zeitraffer durchführen. Hier werde ich die Anzahl der Bilder angeben, die wir aufnehmen möchten. Der erste Kanal wird der Phasenkanal sein.
Die nächste wird von den oberen Perlen sein und die übernächste wird die unteren Perlen sein. Klicken Sie im Fenster mit der mehrdimensionalen Erfassung auf Schließen und dann im zweiten Schritt von AcTrM auf OK. Die Ausgabe wird in dem Verzeichnis gespeichert, das im mehrdimensionalen Erfassungsfenster angegeben ist.
In Aktionsschritt drei wird gefragt, ob das Experiment wiederhergestellt werden muss. Die Antwort lautet in der Regel ja. Hier fragt iTACS, wollen wir eine verfeinerte Wiederherstellung durchführen?
Dieser erste Teil wird uns einer verfeinerten Erholung ziemlich nahe bringen, aber der untere Teil wird uns noch näher an eine höhere Genauigkeit der Neupositionierung bringen. Wenn die Wiederherstellung mit einem begrenzten Sichtfeld durchgeführt wird, wird diese Option angeboten, aber für dieses Experiment werden wir diese Option nicht auswählen. Zu diesem Zeitpunkt ist die Erfassung eines Satzes von Referenzbildern abgeschlossen und Micro-Manager kann geschlossen werden.
Für die Bildaufnahme startet man AcTrM. Wählen Sie die Vergrößerung und das Verzeichnis aus, das Datenordner enthält. Wählen Sie Die Auswahlmöglichkeiten für die Neupositionierung der Platte zusammen mit dem kanal, der für die Neupositionierung verwendet wird.
Es wird eine Schnittstelle bereitgestellt, um das, was gerade in der Kamera zu sehen ist, mit den gespeicherten Bildern abzugleichen. Wenn es Überlappungen gibt, zeigen die Bilder eine rote und grüne Farbe zusammen mit Schwarz an, und eine manuelle Anpassung kann durchgeführt werden. Andernfalls klicken Sie auf Akzeptieren, und der Erwerb wird fortgesetzt.
Wir können jetzt FIJI starten. Wählen Sie die erste Option im MSM-Dropdown-Menü mit der Bezeichnung Vorverarbeitung aus. Wählen Sie dann den Ordner aus, der den Ordner tnimgs enthält.
Als nächstes müssen wir definieren, welcher Kanal welchem Bild entspricht. Für dieses Beispiel ist Kanal 0 das Durchlichtbild, das das Phasenkontrastbild der Zellen ist. Das untere Perlenbild ist Kanal 2 und das obere Perlenbild ist Kanal 1.
Und dann fragt es Sie, wo sich die Zellen kreuzen und welche Seite des Bildes. In diesem Fall handelt es sich bei den Zellen um eine Monoschicht, die sich in Richtung des rechten Rands bewegt, sodass wir die Auswahl von Rechts aufheben und fortfahren. Hier dient ein kleiner Bereich von oberen Perlen, der sich weit von der Monoschicht entfernt befindet, dem gleichen Zweck wie die bilder der unteren Perlen, die spärlicher und größer erscheinen würden als die hier gezeigten.
Jetzt fragt es uns, ob wir die Helligkeit und den Kontrast so verändern wollen, dass die Perlen prominent erscheinen. Also passen wir uns mit den Schiebereglern im Menü an, und sobald die Perlen prominent erscheinen, klicken Sie auf OK. Und jetzt werden wir eine Positionskorrektur durchführen. Wenn es eine Verschiebung gibt, wird es sie loswerden.
Und nachdem es fertig ist, wird der Analyseordner erstellt. Innerhalb des Analyseordners wird der Positionsordner P0 erstellt, und die Auswahlmöglichkeiten, die wir in den vorherigen Vorverarbeitungsmenüs getroffen haben, werden in Analyseoptionen gespeichert, z. B. welche Kanten gekreuzt wurden, Pixelgröße und welches Bild Phasenkontrast und andere ist. Wählen Sie im Dropdown-Menü Monolayer-Spannungsmikroskopie oder MSM die Option MSM-Gelverformung aus.
Von hier aus wählen wir die Option aus, die für unsere Perlenverteilung geeignet ist. Und während die Daten verarbeitet werden, können Sie sehen, dass ein neuer Verschiebungsordner im Positionsordner angezeigt wurde. Hier werden alle Ausgabedateien gespeichert.
Dies zeigt an, dass die Analyse abgeschlossen ist. Wir werden uns ansehen, wie man die Kräfte berechnet, die über die Zell-ECM-Verbindung und die Zell-Zell-Verbindung und auch das Zytoskelett einzelner Zellen der Monoschicht ausgeübt werden. Wählen Sie dazu die dritte Option aus.
Und man wählt das Verzeichnis, das tnimgs und den Analyseordner enthält, was bedeutet, dass man das Beispielverzeichnis und nicht eines dieser Verzeichnisse auswählt. Drücken Sie auswählen, und es wird Sie fragen, was ist der Schubmodul dieses Gels? Der Schubmodul beträgt 1250 und die Dicke des Hydrogels in diesem Beispiel beträgt 118 μm.
Der zu erwartende Geräuschpegel wird hier angegeben. Dann gibt es eine mittlere Verschiebung ist Null Flagge, die in diesem Fall nicht überprüft wird. Wählen Sie OK, und die Implementierung, die die Traktion berechnet, wird über eine MATLAB-Funktion ausgeführt, wie sie in dieser Version von AnViM implementiert ist.
Jetzt ist es bereit, die Berechnung für Zell-Zell- oder Zytoskelettkräfte durchzuführen. Und die erste Frage, die man sich stellen muss, ist die Monoschicht konfluent? In diesem speziellen Fall haben wir eine vorrückende Monoschicht und es gibt einen Bereich ohne Zelle auf der rechten Seite des Rahmens.
Die Antwort ist also, dass die Monoschicht nicht konfluent ist, also werden wir nein sagen. Jetzt werden wir gebeten, ein Polygon um das größte Nicht-Zell-Objekt zu zeichnen. Wir wählen die geeigneten Methoden für die Segmentierung aus.
Hier werden wir aufgefordert, die Farbe der Zellen in den Methoden drei und vier anzugeben, also sind die Zellen hier schwarz, also wählen wir Schwarz. Die Segmentierung, die durch diese verschiedenen Methoden erzeugt wird, endet mit einigen Löchern in der Zellmonoschicht und einigen weißen Bereichen im Nicht-Zell-Bereich. Hier können wir auswählen, Flecken automatisch füllen und OK.So jetzt sind alle Flecken in der Monoschicht gefüllt und keine Zellfläche.
Und dann berechnen wir die mechanischen Spannungen in der zellulären Monoschicht. Wir haben bereits Teil eins durchgeführt, in dem wir die Zellen aus dem Bereich ohne Zelle segmentiert haben, also beginnen wir diesen Schritt mit Teil zwei, der segmentierung der einzelnen Zellen und der Bilder. Man wird die Segmentierung für einzelne Zellen auswählen.
Und hier werden wir aufgefordert, das Positionsverzeichnis auszuwählen. Und es gibt hier einige weitere Informationen für diese Parameter. Dann werden Sie aufgefordert, ein Polygon um die kleinste normale Zelle zu zeichnen.
Was Sie hier zeichnen, wird also verwendet, um die Fläche zu berechnen, und es wird festgelegt, dass alles, was kleiner ist, nicht als Zelle definiert ist. Und als nächstes fragt es nach der größten Zelle. Dann zeichnen wir ein Polygon um die größte normale Zelle, und dann fragt es, welche heller ist?
Ist die Zell-Zell-Schnittstelle heller oder sind die Zellzentren heller? In diesem Fall ist die Zell-Zell-Schnittstelle heller, also werde ich die Zell-Zell-Schnittstelle auswählen. Dies zeigt also an, dass die Berechnung abgeschlossen ist.
Beginnen wir mit der Auswahl der Karte nach Zellenintensitäten. Zunächst fordert iTACS den Benutzer auf, das Positionsverzeichnis auszuwählen, das auch als P0-Ordner bezeichnet wird. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Auswählen.
Dann wird der Benutzer gefragt, ob er oder sie möchte, dass iTACS die Zellteilung erkennt oder die zelluläre Fluoreszenz quantifiziert. In diesem Fall haben wir keine fluoreszierenden Proteine in der Zelle, weshalb wir uns dafür entscheiden werden, die Zellteilung nachzuweisen. Die nächste Folie ermöglicht es dem Benutzer, die Größe der benachbarten Region zu definieren, dies ist eine einzigartige Analyse, die AnViM durchführt, wo es die Eigenschaften einzelner Zellen sowie die Eigenschaften der Zellen benachbarten Region betrachtet.
Hier kann der Benutzer die Breite eines zellennachbaren Bereichs auswählen. In diesem Fall definieren wir die benachbarten Regionen mit 60 Pixeln. Das erste Kontrollkästchen fragt, ob wir möchten, dass iTACS Eigenschaften der Zellen sammelt, ja, und dieses Kontrollkästchen fragt, ob wir möchten, dass iTACS Eigenschaften der Nachbarn sammelt, ja, wir möchten, dass iTACS das auch tut.
Unterhalb dieser Kontrollkästchen stellt iTACS weitere Informationen zu den Kontrollkästchen bereit, wenn der Benutzer weitere Details zu den einzelnen Kontrollkästchen wünscht. Dies zeigt an, dass die Analyse abgeschlossen ist. Auch hier fordert iTACS den Benutzer auf, das Positionsverzeichnis auszuwählen.
Dann hat der Benutzer die Wahl, Kraftdaten abzubilden, Bilder der Kraftdaten zu erstellen, Geschwindigkeitsdaten abzubilden und Bilder der Geschwindigkeitsdaten zu erstellen. Es ist wichtig zu beachten, dass das Erstellen von Bildern Zeit in Anspruch nimmt, so dass man wählen kann, ob man es jetzt tun oder warten kann, um es später zu tun. Aus diesem Grund hat der Benutzer die Möglichkeit, die Auswahl zu treffen oder nicht.
Hier fordert iTACS den Benutzer auf, die Größe der benachbarten Region erneut zu bestimmen, und Sie können die gleiche Größe verwenden, die Sie für die Zuordnung von Intensitäten festgelegt haben, die in unserem Fall 60 Pixel betrug. Und wieder wird der Benutzer gebeten, Eigenschaften der Zellen sowie seiner benachbarten Region zu sammeln. Dies zeigt an, dass die Analyse abgeschlossen ist.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Monolayer-Spannungsmikroskopie oder MSM die Option Ergebnisverfolgungsdaten aus. Zunächst fordert iTACS den Benutzer auf, das Positionsverzeichnis auszuwählen, das auch als P0-Ordner bezeichnet wird. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Auswählen.
Hier fragt iTACS, von welcher Framenummer der Benutzer möchte, dass iTACS mit der Verfolgung von Daten beginnt. Es ist ziemlich sicher, mit dem Tracking von Frame Nummer zwei zu beginnen, da die Geschwindigkeit für Frame Nummer eins nicht bestimmt werden kann. Hier fordert iTACS den Benutzer auf, die maximale Anzahl von Plots anzugeben, die gleichzeitig gefüllt werden sollen.
Und im Wesentlichen ist dies eine Möglichkeit, die Datenverfolgung zu beschleunigen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK, und die Optionen zum Auswählen von Variablen während der Nachverfolgung werden ähnlich wie die Optionen zum Generieren von Heatmaps dargestellt. Allgemeine Eigenschaften von Interesse werden im Textfeld oben im Fenster bereitgestellt.
Wenn Sie jedoch Ihre Variablen anpassen möchten, müssen Sie einfach alles im Textfeld löschen und die unten aufgeführten Spezifischen Eigenschaften auswählen. Wählen Sie im Dropdown-Menü Monolayer-Spannungsmikroskopie oder MSM die Option Ergebnisdiagramm aus. Danach fragt iTACS den Benutzer, ob der Benutzer das Plotten auf Zellen mit ununterbrochener Spur beschränken möchte.
Wenn Sie das Plotten nicht auf ununterbrochene Spuren beschränken möchten, klicken Sie auf Nein.Wenn Sie das Plotten jedoch auf Zellen mit ununterbrochenen Spuren beschränken möchten, klicken Sie auf Ja Hier fragt iTACS, wie viele Variablen der Benutzer vom Programm plotten soll. iTACS ist in der Lage, bis zu drei Variablen zu plotten, und in diesem Fall zeichnen wir nur zwei Variablen, um die Beziehung zwischen diesen Faktoren zu sehen. Wählen Sie im Dropdown-Menü Monolayer-Spannungsmikroskopie oder MSM die Option Ergebnisbild aus.
Hier ist das Positionsverzeichnis, und wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Auswählen. iTACS bittet uns dann, den Startrahmen auszuwählen. Hier haben wir Frame Nummer zwei ausgewählt.
Die Optionen zum Erstellen von Heatmaps werden in ähnlicher Weise dargestellt wie die Optionen zum Zeichnen von Zeitspuren einzelner Zellen. Daraus schließen wir ab, wie man eine Heatmap erstellt. Hier stellt sich die Zeitspur der zellulären Geschwindigkeit in der Zytoskelettspannung für Zelle Nummer eins dar.
Die Eigenschaften werden auf einer gemeinsamen vertikalen Achse angezeigt, und die horizontale Achse zeigt die Zeitinstanznummer an, wobei die Frames in 15-Minuten-Intervallen erfasst werden. Die zweite Ausgabe ist ein Array von Heatmaps eine Stunde nach Beginn des Experiments. Zu den hier gezeigten Eigenschaften gehören Ausbreitungsfläche, Orientierung, Zirkularität, Geschwindigkeit, Bewegungsrichtung, maximale Spannungsorientierung, Zytoskelettspannung, Substrattraktionen und Spannungsanisotropie einzelner Zellen.
Dies ist also ein Einblick in eine Reihe von Experimenten. Es gibt mehrere andere experimentelle Situationen, in denen AnViM und AcTrM dem Benutzer helfen können, das Experiment reproduzierbar durchzuführen, und diese Kontakte sind im Manuskript aufgeführt. Zu den wichtigsten Funktionen von iTACS gehören die Automatisierung des experimentellen Protokolls, die automatisierte Datenanalyse und es ist kein technischer Hintergrund erforderlich.
