Die Strahlentherapie wird am häufigsten mit Linearbeschleunigern geliefert. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die biologischen Auswirkungen von Strahlung auf Zellen mit einem Linearbeschleuniger zu bewerten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass Forscher mit Hilfe eines Linearbeschleunigers eine breite Palette klinisch relevanter Dosen und Dosisraten untersuchen können.
Darüber hinaus kann dieses Protokoll für alle Arten von Krebszellen verwendet werden. Diese Methode kann mit ähnlichen Geräten wie die hier gezeigten durchgeführt werden. Zum Beispiel Linearbeschleuniger, die von anderen Anbietern hergestellt werden.
Personen, die nicht in der Durchführung dosimetrischer Berechnungen mit einem Linearbeschleuniger erfahren sind, können Schwierigkeiten haben, die richtige Anzahl von Monitoreinheiten zu berechnen, die erforderlich sind, um die gewünschte Dosis an die Probe zu liefern. Sie würden davon profitieren, wenn sie sich von einem erfahrenen Medizinphysiker oder Dosimetristen beraten lassen. Die genaue Abgabe der Dosis an die Probe mit einem Linearbeschleuniger erfordert eine sorgfältige Platzierung.
Zwei Tage vor der geplanten Bestrahlung, die in einer Kulturhaube arbeitet, verwenden Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Pipette, um Gliom-Stamm-ähnliche Zellen von einer Kulturplatte in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g für drei Minuten in einer Arbeitsplatte Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter Trypsin-EDTA wieder auf.
Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um das Pellet zu verdauen und eine Einzelzellsuspension in Trypsin-EDTA zu machen. Alle zwei Minuten während der Verdauung, schütteln Sie vorsichtig den Boden des Zentrifugenrohrs, um sicherzustellen, dass die Zellen gründlich verdaut werden. Dann fügen Sie drei Milliliter Stammzellkulturmedien hinzu, um Trypsin zu löschen, sanft zu mischen und zentrifugieren bei 200 mal g für drei Minuten in einer Arbeitsplatte Zentrifuge.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes, setzen Sie das Zellpellet mit fünf Milliliterzellkulturmedien wieder auf und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Platte fünf Millionen Zellen in zwei 10-Zentimeter-Platten mit 10 Milliliterzellkulturmedien geteilt und inkubieren 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Unmittelbar vor der geplanten Bestrahlung die Zellen und Zentrifugen wie zuvor sammeln.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern Zellkulturmedien wieder auf. Übertragen Sie einen Milliliter Zellsuspension in eine 35-Millimeter-Platte mit zwei Milliliterzellkulturmedium, um sicherzustellen, dass das Medium eine Höhe von einem Zentimeter erreicht. Übertragen Sie die vergoldeten Zellen in einen sekundären Behälter, um das Kontaminationsrisiko zu verringern, und bringen Sie die Zellen im Behälter auf einem Gebrauchswagen zur Bestrahlungsanlage, um die Zellen zu bestrahlen.
Einen Tag vor der Bestrahlung, die in der Zellkulturhaube arbeitet, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, die mit einem Vakuum verbunden ist, um DMEM-Medium von der Zellkulturplatte an die angeschlossene Zelllinie zu entfernen. Dann waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern sterilen PBS, um Restmedium abzuspülen. Fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA in das Kulturgericht und neigen Sie die Kulturplatte vorsichtig, um sicherzustellen, dass das gesamte Gericht abgedeckt ist.
Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten, löschen Sie die Trypsin-EDTA-Reaktion mit drei Milliliter DMEM-Medien. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellen in 15 Milliliter Zentrifugenrohr, Zentrifuge zu sammeln, und kulticultureieren Sie dann die Zellen, wie im Manuskript beschrieben. Um diese zuvor vorbereiteten Zellen mit der Konsolensoftware des LINAC zu bestrahlen, stellen Sie den Beschleunigerportal und den Kollimator auf null Grad, öffnen Sie die x- und y-Kiefer auf eine symmetrische Feldgröße von fünf mal fünf Quadratzentimetern und ziehen Sie die mehrblättrigen Kollimatoren zurück.
Fügen Sie mindestens fünf Zentimeter wasseräquivalentes Material auf die Behandlungscouch und legen Sie die zu bestrahlende Zellschale in die Mitte der LINAC-Fadenkreuze. Legen Sie die Zellen in einer maximalen Dosistiefe in einen sechs Megavolt-Röntgenstrahl um 1,5 Zentimeter und fügen Sie einen zusätzlichen Zentimeter wasseräquivalentes Material auf die Schale. Befestigen Sie den vorderen Zeiger am Kopf des LINAC und verlängern Sie ihn, bis er die Oberfläche des Aufbaumaterials berührt.
Passen Sie die Tischhöhe an, bis der Abstand von der Quelle zur Aufbaufläche 100 Zentimeter beträgt. Verlassen Sie den Behandlungstresor, um sicherzustellen, dass alle anderen Personen gegangen sind. Stellen Sie sicher, dass sich keine anderen Zellen im Raum befinden, und schließen Sie dann die Tresortür.
Bestätigen Sie die Feldgröße, überwachen Sie Einheiten und überwachen Sie Einheiten pro Minute an der Konsole, und aktivieren Sie dann den Strahl für eine Strahlungszelle. Mit diesem Protokoll wurden drei Proben von Gliom-Stammzellen hergestellt und 24 Stunden nach der Bestrahlung gesammelt. Dort wurden Zellzyklusprofile berechnet und mit den Prozentsätzen der Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus dargestellt.
Der G2-Zellzyklusstillstand wurde nach Bestrahlung von Gliom-Stammzellen mit einer Standarddosisrate oder einer extra hohen Dosisrate im Vergleich zu nicht bestrahlten Kontrollzellen beobachtet. Um die richtige Dosis liefern zu lassen, ist es am wichtigsten, die Höhe der Medien im Kulturgericht zu messen, um sicherzustellen, dass sie einen Zentimeter erreicht. Nach diesem Verfahren können andere biologische Tests durchgeführt werden, wie Z. B. Immunfärbung, Western Blot und Zellzyklusanalyse.
Da dieses Verfahren den Forschern klinisch relevante Dosis- und Dosisrateneinstellungen bietet, kann es verwendet werden, um die Strahlenwirkung auf vielen zellkulturbasierten Modellen zu bewerten.
