방사선 요법은 선형 가속기를 사용하여 가장 자주 전달됩니다. 이 프로토콜은 연구원이 선형 가속기를 사용하여 세포에 방사선의 생물학적 효력을 평가할 수 있게 합니다. 이 기술의 장점은 선형 가속기를 사용하여 연구자들은 임상적으로 관련된 다양한 용량과 용량 비율을 연구 할 수 있다는 것입니다.
더욱이, 이 프로토콜은 암세포의 모든 모형을 위해 이용될 수 있습니다. 이 방법은 여기에 표시된 것과 유사한 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어 다른 공급업체에서 제조한 선형 가속기입니다.
선형 가속기를 사용하여 도시메트릭 계산을 수행하는 데 경험이 없는 개인은 원하는 용량을 샘플에 전달하는 데 필요한 정확한 모니터 단위 수를 계산하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 그(것)들은 경험 의학 물리학자 또는 점안사에게서 조언을 구함으로써 유익할 것입니다. 선형 가속기를 사용하여 시료에 용량을 정확하게 전달하려면 신중한 배치가 필요합니다.
예정된 조사 이틀 전에, 배양 후드에서 일하는 멸균 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 배양 판에서 신경교종 줄기와 같은 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다. 원심 분리기는 싱크대 원심분리기에서 3분 동안 200배 g의 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 트립신-EDTA의 1 밀리리터로 셀 펠릿을 다시 놓습니다.
펠릿을 소화하고 트립신-EDTA에서 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 소화 중 2분마다 원심분리기 튜브바닥을 부드럽게 흔들어 세포가 철저히 소화되도록 합니다. 그런 다음 줄기 세포 배양 매체의 3 밀리리터를 추가하여 트립신을 담금질하고 부드럽게 혼합하고 원심분리기를 200회 g에서 싱크로원심분리기에서 3분간 첨가합니다.
상체를 폐기한 후, 세포 배양 배지의 5밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단하고 혈류계로 세포를 계산한다. 플레이트 5백만 개의 세포는 세포 배양 배지 의 10 밀리리터를 포함하는 2개의 10센티미터 판으로 나누고 섭씨 37도에서 48시간을 배양합니다. 예정된 조사 직전에 이전과 마찬가지로 세포와 원심분리기를 수집합니다.
상체를 버리고 세포 배양 배지의 5 밀리리터로 세포 펠릿을 재중단합니다. 세포 배양 배지의 2밀리리터를 포함하는 35 밀리미터 플레이트로 세포 현탁액1 밀리리터를 전달하여 배지가 1센티미터의 높이에 도달하는지 확인합니다. 도금 된 세포를 이차 용기로 옮겨 오염 위험을 줄이고 유틸리티 카트의 용기에 있는 세포를 조사 시설로 가져와 세포를 조사합니다.
조사 하루 전에 세포 배양 후드에서 작업하는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포 배양판에서 부착된 세포주까지 DMEM 배지를 제거합니다. 그런 다음 멸균 PBS의 5 밀리리터로 세포를 씻어 잔류 배지를 헹구는 것입니다. 트립신-EDTA 1밀리리터를 문화 요리에 넣고 배양 판을 부드럽게 기울여 전체 접시가 덮여 있는지 확인합니다.
실온에서 5분 동안 배양한 후, DMEM 미디어의 3밀리리터로 트립신-EDTA 반응을 담금질한다. 5 밀리 리터 파이펫을 사용하여 15 밀리리터 원심분리기 튜브, 원심분리기로 세포를 수집한 다음 원고에 설명된 바와 같이 세포를 배양합니다. LINAC의 콘솔 소프트웨어를 사용하여 이전에 준비된 이러한 세포를 조사하려면 가속기 갠트리및 콜리메이터를 0도로 설정하고 x 와 y 턱을 대칭 5xx의 대칭 5로 열고 멀티리프 콜리메이터를 철회합니다.
처리 소파에 물 등가물 물질의 적어도 5 센티미터를 추가하고 LINAC 십자선의 중심에 조사 할 세포 접시를 배치합니다. 세포를 최대 용량의 깊이에 최대 용량의 깊이에 배치 약 1.5 센티미터 의 6 메가 볼트 X 선 빔과 접시 위에 물 등가 물질의 추가 1 센티미터를 추가. 앞포인터를 LINAC의 머리에 부착하고 빌드업 재료의 표면에 닿을 때까지 확장합니다.
소스에서 축적 표면까지의 거리가 100cm가 될 때까지 테이블 높이를 조정합니다. 치료 금고를 떠나 다른 모든 개인이 떠났는지 확인하십시오. 방에 다른 셀이 없는지 확인한 다음 볼트 도어를 닫습니다.
콘솔에서 분당 필드 크기, 모니터 장치 및 모니터 유닛을 확인한 다음 방사선 셀에 빔을 활성화합니다. 신경교종 줄기 와 같은 세포의 3개의 견본은 이 프로토콜을 사용하여 준비하고 조사 후에 24 시간을 집합했습니다. 거기 세포 주기 단면도계산 하 고 세포 주기의 다른 단계에서 세포의 백분율로 표시 되었다.
G2 세포 주기 체포는 비조사 대조군 세포와 비교하여 표준 투여량 비율 또는 추가 고용량 비율로 신경교종 줄기 세포의 조사 후에 관찰되었습니다. 올바른 복용량을 전달하기 위해, 그것은 1 센티미터에 도달 있는지 확인하기 위해 문화 접시에서 미디어의 높이를 측정하는 것이 가장 중요합니다. 이 절차에 이어 면역염색, 서부 블롯 및 세포 주기 분석과 같은 다른 생물학적 분석이 수행될 수 있다.
이 절차는 연구원에게 임상적으로 관련 된 복용량 및 복용량 속도 설정을 제공 하기 때문에, 그것은 많은 세포 배양 기반 모델에 방사선 효과 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.
