放射線療法は、最も頻繁に線形加速器を使用して提供される。このプロトコルは、研究者が線形加速器を使用して細胞に放射線の生物学的影響を評価することを可能にする。この技術の利点は、線形加速器を使用することにより、研究者は臨床的に関連する用量および用量率の広い範囲を研究することができるということです。
さらに、このプロトコルは、すべてのタイプの癌細胞に使用することができる。この方法は、ここに示す同様の装置を使用して実行できます。たとえば、他のベンダーによって製造された線形加速器。
線形加速器を使用して線量計算を行う経験がない個人は、サンプルに所望の線量を提供するために必要なモニターユニットの正しい数を計算するのに苦労するかもしれません。彼らは経験医学物理学者やドジメトリストからのアドバイスを求めることによって利益を得るでしょう。線形加速器を使用して正確にサンプルに線量を提供するには、慎重な配置が必要です。
予定された照射の2日前に、培養フードで働き、無菌5ミリリットルピペットを使用して、培養プレートから15ミリリットル遠心分離管にグリオーマ幹細胞状細胞を採取する。細胞をカウンタートップ遠心分離機で3分間200回gで遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを1ミリリットルのトリプシン-EDTAで再懸濁します。
ペレットを消化し、トリプシン-EDTAで単一の細胞懸濁液を作るために室温で5分間インキュベートします。消化中に2分ごとに、遠心分離管の底を軽く振って細胞が完全に消化されるようにします。その後、3ミリリットルの幹細胞培養培地を加えてトリプシンをクエンチし、カウンタートップ遠心分離機で200回gで静かに混合し、遠心分離機を3分間加えます。
上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの細胞培養培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞を数える。500万個の細胞を10センチメートルのプレートに分け、10ミリリットルの細胞培養培地を含み、摂氏37度で48時間インキュベートする。予定された照射の直前に、前に行われたように細胞と遠心分離機を収集します。
上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの細胞培養培地で再懸濁する。細胞懸濁液を1ミリリットルを2ミリリットルの細胞培養培地を含む35ミリプレートに移し、培地が1センチメートルの高さに達することを確認する。メッキされた細胞を二次容器に移して汚染の危険を減らし、ユーティリティカートの容器内の細胞を照射施設に持ち込んで細胞を照射する。
照射の1日前に、細胞培養フードで働き、真空に接続されたパスツールピペットを使用して、取り付けられた細胞株に細胞培養板からDMEM培地を除去する。その後、残留培地を洗い流すために5ミリリットルの無菌PBSで細胞を洗います。培養皿にトリプシンEDTAを1ミリリットル加え、培養プレートを軽く傾けて皿全体が覆われていることを確認します。
室温で5分間インキュベートした後、3ミリリットルのDMEM培地でトリプシン-EDTA反応を焼き付けます。5ミリリットルピペットを使用して細胞を15ミリリットル遠心管、遠心分離機に集め、次に原稿に記載されているように細胞を培養する。LINACのコンソールソフトウェアを使用して以前に準備したセルを照射するには、アクセラレータガントリーとコリメータをゼロ度に設定し、xとyの顎を対称5×5平方センチメートルのフィールドサイズに開き、マルチリーフコリメーターを後退させます。
処理ソファに水に相当する材料を少なくとも5センチメートル加え、照射するセル皿をLINAC十字線の中心に置きます。1.5センチメートル前後の6メガボルトX線ビームに最大線量の深さで細胞を置き、皿の上にさらに1センチメートルの水に相当する材料を追加します。LINACの頭部にフロントポインタを貼り付け、構築材料の表面に触れるまで伸ばします。
ソースから構築サーフェスまでの距離が 100 センチメートルになるまで、テーブルの高さを調整します。治療保管庫を離れ、他のすべての個人が去っていることを確認します。部屋に他のセルがないことを確認し、ボルトのドアを閉じます。
フィールドサイズ、モニタユニット、モニタユニットをコンソールで1分あたりに確認し、放射線のセルに対してビームを有効にします。グリオーマ幹細胞の3つのサンプルをこのプロトコルを用いて調製し、照射後24時間回収した。そこに細胞周期プロファイルを計算し、細胞周期の異なる段階で細胞のパーセンテージで示した。
G2細胞周期停止は、非照射対照細胞と比較して、標準的な線量率または余分な高用量率でグリオーマ幹細胞を照射した後に観察された。適切な用量を提供するためには、培養皿中の培地の高さを測定して、1センチメートルに達することを確認することが最も重要です。この手順に従って、免疫染色、ウェスタンブロット、および細胞周期解析などの他の生物学的アッセイを行うことができる。
この手順は、研究者に臨床的に関連する線量および線量率の設定を提供するので、多くの細胞培養ベースのモデルに対する放射線効果を評価するために使用することができる。
