Dieses Protokoll vergleicht die beiden am weitesten verbreiteten hyperspektralen kohärenten Raman-Streutechniken, einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung und der stimulierten Raman-Streuprozesse, und dies ermöglicht es den Biologen, die beste Bildgebungsmodalität für ihre biologischen Anwendungen zu wählen. Mithilfe der intrinsischen Schwingungssignaturen ist die kohärente Raman-Spektroskopie in der Lage, chemische Informationen und biologische Proben zu kartieren, ohne dass eine exogene Markierung erforderlich ist. Die kohärente Raman-Mikroskopie hat unser Verständnis des Zellstoffwechsels, der Kartierung, der Arzneimittelverteilung, der Krankheitsdiagnostik und der Quantifizierung chemischer Veränderungen erweitert.
Dies ist eine Technik, die eine ausreichende Ausbildung sowohl in der Optik als auch in der Spektroskopie erfordert. Ich würde empfehlen, ein paar Übersichtsartikel zu lesen und von einem Experten geschult zu werden, bevor ich diese Technik anwende. Bereiten Sie zunächst die Bildfolien vor, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Deckzettel legen und eine kleine rechteckige Form des Bandes aus der Mitte des Bandes ausschneiden, um einen offenen Bereich für die zu platzierende Probe zu schaffen.
Pipette 1 bis 2 Mikroliter reines DMSO und dosieren Sie das Tröpfchen in der Mitte des Leerstands. Platzieren Sie den oberen Deckschlitten vorsichtig und platzieren Sie vorsichtig die Kanten der Abdeckschlitten, um die Kammer abzudichten, während Sie sicherstellen, dass die DMSO-Probe nicht mit den Rändern des Bandes in Berührung kommt. Für Sensitivitätsexperimente bereiten Sie serielle Verdünnungen von DMSO in Deuteriumoxid vor, um einen Konzentrationsbereich von 50 bis 0% zu erhalten. Nehmen Sie 1 bis 2 Mikroliter jeder Lösung und bereiten Sie gepresste Proben vor, wie zuvor gezeigt.
Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und fügen Sie bei Bedarf Wasser oder Tauchöl für die Objektivlinse oder den Kondensator hinzu. Bewegen Sie den Rand des DMSO-Tröpfchens ordnungsgemäß im Sichtfeld und stellen Sie die Objektivlinse für den besten Fokus ein, zentrieren Sie dann den Kondensator mit der Kohler-Beleuchtungsmethode und öffnen Sie die Membran am Kondensator vollständig. Als nächstes stimmen Sie die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 800 Nanometer ab, um die 2913-Wellenzahl CH3-Spitze anzuvisieren, und stellen Sie die Leistung sowohl der Pumpe als auch des Stokes-Strahls auf etwa 30 Milliwatt vor dem Mikroskop ein, indem Sie die Halbwellenplatte einstellen.
Stellen Sie für SRS die Lock-in-Verstärkerverstärkung auf etwa 10 mit einer Zeitkonstante von 7 Mikrosekunden ein, um sicherzustellen, dass die Zeitkonstante kleiner ist als die Pixelverweildauer. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter und die Erfassungssoftware mit einer Pixelzahl von 200 x 200 mit einer Scangröße von etwa 100 x 100 Quadratmikrometern ein, stellen Sie sicher, dass das Bild sowohl das DMSO-Tröpfchen als auch einen leeren Bereich enthält, scannen Sie dann die Probe und überprüfen Sie das Bild auf dem Computerbildschirm. Als nächstes scannen Sie das motorisierte Verzögerungsbild im Stokes-Pumpenstrahl, während Sie die Echtzeitbilder überwachen, und scannen Sie über die Verzögerung, bis das Signal maximiert ist.
Bewegen Sie den DMSO-Tropfen, um das gesamte Sichtfeld abzudecken, und prüfen Sie, ob das DC-Signalmaximum im Bild zentriert ist, da das Signal pumpenstrahlabhängig ist. Stellen Sie entweder die Position des Pumpenstrahls über einen Spiegel oder den Spannungsversatz in der Bildgebungssoftware ein. Passen Sie nach der DC-Optimierung die Stokes-Strahlspiegel an, bis das AC-Signal maximiert ist, indem Sie den Schwellenwert so einstellen, dass eine Sättigung von etwa 50 % angezeigt wird, während Sie überprüfen, ob die Sättigung im Bild zentriert ist.
Wenn nicht, stimmen Sie die Spiegel nur im Stokes-Strahl ab und überwachen Sie das Signal während der Ausrichtung als Echtzeit-Feedback über die Qualität der Ausrichtung. Öffnen Sie für die SNR-Analyse die ImageJ-Software und importieren Sie die gespeicherte DMSO-Beispieltextdatei, indem Sie auf Datei, dann auf Importieren und anschließend auf die Optionen Textbild und Öffnen aus dem Dropdown-Menü klicken. Sobald das Bild importiert wurde, drücken Sie die Strg-Umschalttaste C, um die Helligkeits- und Kontrastfunktion aufzurufen, und drücken Sie dann die Auto-Taste in der Helligkeits- und Kontrastfunktion, bis der Bereich des DMSO-Samples gesättigt erscheint, um das maximale Sample-Signal zu finden.
Klicken Sie anschließend auf der ImageJ-Benutzeroberfläche auf das Auswahlwerkzeug "Oval" und markieren Sie einen kleinen Bereich des gesättigten DMSO-Bereichs. Drücken Sie nach dem Markieren M, um den Mittelwert und die Standardabweichung des ausgewählten Bereichs zu messen. Um den Hintergrund zu messen, passen Sie die Balken in der Helligkeits- und Kontrastfunktion an, bis das Signal des leeren Bereichs beobachtet werden kann, klicken Sie dann auf die Option "Oval" und markieren Sie einen Bereich des Hintergrunds, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich kein DMSO enthält.
Drücken Sie anschließend M, um die Statistiken des ausgewählten Bereichs zu messen. Als nächstes berechnen Sie die SNR wie zuvor gezeigt, indem Sie den Rauschmittelwert und den Signalmittelwert zusammen mit der Standardabweichung messen. Um die hyperspektralen CRS-Bilder zu verarbeiten, importieren Sie die Textdatei, indem Sie im Dropdown-Menü auf Datei und dann auf Importieren, Textbild und Öffnen klicken.
Klicken Sie nach dem Import auf Image, dann auf Stacks, gefolgt von Tools und Montage to Stack-Optionen, um die Datei in einen Image-Stack zu konvertieren, und scrollen Sie dann durch die Montage, bis der erste DMSO-Peak sichtbar ist. Wählen Sie einen Bereich auf dem DMSO aus und klicken Sie auf Bild, gefolgt von den Optionen Stapel und Z-Achsenprofil plotten, um das Spektrum der Intensität im Vergleich zur Bildzahl darzustellen. Klicken Sie anschließend auf Liste und kopieren Sie die Profildaten, um die Spektralrohdaten zu extrahieren.
Um das wiedergewonnene Spektrum in Frequenzeinheiten umzuwandeln, führen Sie eine lineare Regression durch, indem Sie die symmetrische und asymmetrische CH verwenden, die sich von DMSO und den entsprechenden Bildnummern erstreckt. Die spektrale Auflösung des DMSO wurde mit einer hyperspektralen SRS- und CARS-Mikroskopie gemessen, die eine Auflösung von 14,6 bzw. 17,1 Wellenzahl zeigen, was darauf hindeutet, dass SRS eine bessere spektrale Auflösung hat. Die DMSO-SRS-Spektren wurden bei Konzentrationen von 0,1 und 0,01% erhalten, in denen der Peak bei der Wellenzahl 2913 in der ersten, aber nicht in der letzteren aufgelöst werden kann, was darauf hinweist, dass die Nachweisgrenze zwischen 0,1 und 0,01% DMSO liegt.
Die phasenabgerufenen CARS-Spektren zeigen, dass der DMSO 2913-Wellenzahl-Peak für die 0,1%DMSO eindeutig aufgelöst werden kann, aber nicht für die 0,01%, die eine Nachweisgrenze zwischen diesen beiden Konzentrationen anzeigt. SRS- und CARS-Intensitätsprofile einer MIA PaCA-2-Zelle zeigten, dass das SRS-Signal eine Auflösung von 398,6 Nanometern ergab, während das CARS-Signal eine 1,2-mal bessere Auflösung von 330,3 Nanometern ergab. Die SRS- und CARS-Bilder von MIA PaCa-2-Zellen an verschiedenen optischen Verzögerungspositionen zeigen die stärksten Signale mit Lipidtröpfchen als helle Punkte für SRS, während CARS stark reduzierte Kontraste aufweisen.
Eine Rotverschiebung der Spektralfokussierung um 37 Wellenzahlen verbesserte jedoch die Lipidkontraste sowohl für SRS als auch für CARS. Die SRS-Spektren zeigen bei einer Wellenzahl von 2850 ein viel stärkeres Signal für Lipidtröpfchen als andere Organellen, während die CARS-Spektren eine kleine Rotverschiebung aufweisen. Um das kohärente Raman-Streusignal zu optimieren, finden Sie zuerst den Sample-Fokus, stimmen Sie dann die optische Verzögerung ab und optimieren Sie schließlich die Spiegel, bis ein Maximum erreicht ist.
Andere Pump-Sonden-Technologien, wie die transiente Absorption, sind inhärent in die CRS-Plattform integriert. Diese Technologie ist sehr leistungsfähig für die Messung der Absorptionskinetik von starken, lichtabsorbierenden nicht-fluoreszierenden Molekülen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, kleine Moleküle markierungsfrei mit hoher chemischer Zellaktivität zu betrachten.
Es ermöglicht den Forschern auch, Veränderungen im Fettstoffwechsel, in der intrazellulären Dynamik und in der Arzneimittelverteilung zu betrachten.
