Die In-Vivo-Bildgebung von biologischem Gewebe mit subzellulärer Auflösung und chemischer Spezifität ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau beteiligt sind. Mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie können kritische biochemische und biophysikalische Informationen biologischer Gewebe aus mehreren Perspektiven mit subzellulärer Auflösung erfasst werden. Insbesondere kann diese dual-modale Mikroskopie verwendet werden, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen im Rückenmark der Maus abzubilden, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen.
Schalten Sie zunächst den Titan-Saphirlaser ein, indem Sie den Schlüsselschalter von der Standby- in die Ein-Position schalten und 30 Minuten warten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Schalten Sie dann den OPO ein, indem Sie auf die Starttaste auf dem OPO Control Panel klicken und warten Sie 20 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Nachdem sich der Pikosekundenlaser erwärmt hat, überprüfen Sie die Modulationstiefe des Stokes-Strahls, indem Sie die Leistung des Stokes-Strahls auf etwa 20 Milliwatt senken, den Laserverschluss für den Stokes-Strahl öffnen und einen Hochgeschwindigkeits-Fotodetektor am OPO-Ausgang platzieren, um den Strahl zu erkennen.
Als nächstes verbinden Sie den Ausgangsanschluss des Photodetektors mit dem Eingangsanschluss eines Oszilloskops über ein Koaxialkabel mit einem BNC-Anschluss, um den Laserpuls zu überwachen. Öffnen Sie dann das EOM-Steuerungsfenster in der OPO-Steuerungssoftware und passen Sie die EOM-Leistung und -Phase entsprechend dem auf dem Oszilloskop gezeigten Pulsintensitätsdiagramm an, um eine maximale Modulationstiefe von 20 Megahertz zu erreichen. Öffnen Sie in der OPO-Steuerungssoftware den Laserverschluss der Pumpe, während Sie die Stokes-Ausgabe stoppen.
Klicken Sie anschließend auf das Stellwerk, um die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 796 Nanometer einzustellen, klicken Sie dann auf die eingestellte OPO-Stromversorgungsbox und geben Sie 20 ein, um die Leistung für die optische Ausrichtung auf das Minimum einzustellen. Als nächstes platzieren Sie die Ausrichtungsplatte P1 hinter dem polarisierenden Strahlteiler bei etwa 10 Zentimetern und platzieren Sie die Platte P2 hinter P1 bei etwa 30 Zentimetern auf dem optischen Weg. Nachdem Sie den Mikroskopverschluss für den Pikosekunden-Laserstrahl geöffnet haben, stellen Sie den Spiegel M1 so ein, dass er die Pikosekunden-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P1 lokalisiert. Verwenden Sie ein Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P1 beim Einstellen des Spiegels M1 zu beobachten. Stellen Sie den Spiegel M2 entsprechend ein, um die Pikosekunden-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren. Verwenden Sie das Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P2 beim Einstellen des Spiegels M2 zu beobachten. Nachdem Sie die Spiegel eingestellt haben, bis sich die Pikosekundenstrahlmitte am Durchgangsloch beider Ausrichtungsplatten befindet, schließen Sie den Verschluss des Pikosekundenstrahls in der Mikroskopsteuerungssoftware.
Öffnen Sie als Nächstes den Mikroskopverschluss für den Femtosekunden-Laserstrahl. Stellen Sie den Spiegel M3 so ein, dass er das Femtosekunden-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P1 lokalisiert, und stellen Sie dann den Spiegel M4 so ein, dass er das Femtosekunden-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P2 lokalisiert. Nachdem Sie die Spiegel eingestellt haben, bis sich die Femtosekunden-Laserstrahlmitte an den Durchgangslöchern der beiden Ausrichtungsplatten befindet, schließen Sie den Mikroskopverschluss für den Femtosekundenstrahl. Platzieren Sie als Nächstes eine Kamera an der Position des Objektivs, um die Position der beiden Strahlpunkte zu visualisieren, und markieren Sie die Position des Pumpstrahls auf dem Kamerabildschirm als Referenz.
Platzieren Sie dann eine Ausrichtungsplatte P0 vor dem Objektiv L3 und stellen Sie den optischen Spiegel mit einer Hex-Taste so ein, dass die Stokes-Strahlmitte das Durchgangsloch der Ausrichtungsplatte am Laserausgangsanschluss passiert. Verwenden Sie das Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P0 während der Einstellung zu bestätigen. Entfernen Sie als Nächstes die Ausrichtungsplatte P0 und verwenden Sie die Hex-Taste, um den optischen Spiegel zwei so einzustellen, dass die Mitte des Stokes-Strahls mit der Referenzmarkierung des Pumpstrahls auf der Kamera kolokalisiert wird.
Stellen Sie die Spiegel so lange ein, bis sich der Stokes-Strahl sowohl bei P0 als auch bei den Kameraebenen strikt mit dem Pumpenstrahl überlappt. Öffnen Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware und stellen Sie die Wellenlänge des Pumpenlasers auf 796 Nanometer und die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 50 bzw. 70 Milliwatt ein, was 15 bzw. 25 Milliwatt auf der Probe entspricht. Verwenden Sie dann Olivenöl für die Optimierung der Lock-in-Verstärkerphase.
Das Olivenöl wird in einem Objektträger mit Seidenpapier an der Unterseite versiegelt, um die Signalrückstreuung oder EPI-SRS-Erkennung zu verbessern. Legen Sie die Olivenölprobe auf die Bühne und stellen Sie den Fokus des 25X-Objektivs auf die Probe ein. Stellen Sie mit der Mikroskopsteuerungssoftware die Bildgebungsparameter ein, wie im Textmanuskript erwähnt.
Stellen Sie dann mit der Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware den Zeitkonstantenwert auf 10 Mikrosekunden ein. Als nächstes scannen Sie den Laserstrahl über die Probe und stimmen die Phase mit einer Schrittweite von 22,5 Grad ab, bis die SRS-Signalintensität das Maximum erreicht. Scannen Sie dann die Probe mit geschlossenem Laserverschluss und stimmen Sie den Offset-Wert mit einer Schrittweite von einem Millivolt ab, bis das durchschnittliche SRS-Signal nahe Null liegt.
Öffnen Sie als Nächstes den Verzögerungsmanager-Dialog in der OPO-Steuerungssoftware und scannen Sie das Olivenöl, wobei Sie die Verzögerungsstufe abstimmen, bis das Olivenöl-SRS-Signal sein Maximum erreicht. Stoppen Sie dann den Scanvorgang und klicken Sie im Dialogfeld "Verzögerungsmanager" auf die Schaltfläche "Daten hinzufügen", um die aktuellen Verzögerungsdaten aufzuzeichnen. Nachdem Sie auf ähnliche Weise Verzögerungsdaten an verschiedenen Raman-Verschiebungen durch die Abbildung verschiedener chemischer Proben erfasst haben, wählen Sie die Datenanpassung in der Reihenfolge fünf im Verzögerungsmanagerdialogfeld, um die aktuellen Datenpunkte mit der polynomischen Funktion fünfter Ordnung abzugleichen.
Wenden Sie dann die angepassten Daten an, indem Sie auf die Schaltfläche Als benutzerdefiniert verwenden klicken und das Kontrollkästchen aktivieren. Die Verzögerungsstufe wird bei verschiedenen Wellenlängen entsprechend der angepassten Verzögerungskurve automatisch angepasst. Für die In-vivo-Bildgebung fixieren Sie die Maus auf der Stabilisierungsstufe, wobei ihr Rückenmark freigelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht ist.
Montieren Sie nun die Stabilisierungsstufe auf einer Fünf-Achsen-Stufe unter dem TPEF-SRS-Mikroskop. Sichern Sie dann den Mauskopf mit zwei Kopfstangen und senken Sie die Halteplatte ab, um genügend Platz für Brustbewegungen während der Atmung zu bieten und Bewegungsartefakte zu lindern. Als nächstes passen Sie das Z-Translationsstadium an, um den Fokus so einzustellen, bis das Hellfeldbild der Rückenmarksvaskulatur unter einem 10X-Objektiv beobachtet werden kann.
Lokalisieren Sie die Rückenmarksvene in der Mitte des Sichtfeldes, indem Sie die zweiachsige Translationsstufe der fünfachsigen Stufe abstimmen. Passen Sie als Nächstes die Roll- und Nickwinkel der Fünf-Achsen-Stufe an, um die Rückenmarksoberfläche senkrecht zur Objektivachse basierend auf dem Hellfeldbild anzupassen. Ersetzen Sie dann das 10X durch ein 25X Wassertauchobjektiv für die TPEF-SRS-Bildgebung.
Für die SRS-Bildgebung wählen Sie den Polarisationsstrahlteiler über dem Objektiv aus, indem Sie die Schalttaste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist. Wählen Sie für die TPEF-Bildgebung den dichroitischen Spiegel D2 über dem Objektiv aus, indem Sie die Schalttaste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist. Stellen Sie abschließend die Bildgebungsparameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und beginnen Sie mit dem Scannen der Probe.
In vivo zeigte die dual-modale Bildgebung von spärlich markierten YFP-Axonen und Myelinscheiden im Rückenmark der Maus, dass die Axone eng von einer dicken Schicht von Myelinscheiden umwickelt sind. Wie im TPEF-SRS-Rückenmarksbild zu sehen ist, haben die Knoten von Ranvier einen verringerten axonalen Durchmesser und das Axilemma ist direkt der extrazellulären Matrix ausgesetzt. In Kombination mit neuen Sonden für Fluoreszenz und SRS-Bildgebung mit Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz kann die SRS-Mikroskopie eine gleichzeitige strukturelle und funktionelle Bildgebung verschiedener Biomoleküle erreichen, was unser Verständnis komplexer biologischer Prozesse erleichtert.
