Dieses Massenzytometrie-Protokoll bewahrt die Integrität des gesamten Knochenmarks und ermöglicht die Rettung der Informationen, die während der konventionellen Probenvorbereitung für die Analyse unter untersuchter Zellen verloren gegangen sind. Dieses schnelle und mühelose Knochenmark-Isolationsprotokoll erleichtert den Erwerb lebensfähiger kurzlebiger myeloischer Zellpopulationen wie seltener Neutrophilen-Lineage-Subsets. Die Verwendung von Massenzytometrie zur Identifizierung zuvor unterschätzter Immunzellen wie Neutrophilen-Linienzellen kann weitreichende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten haben.
Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der kurzlebigen myeloischen Zellen, die im Knochenmark vorhanden sind und leicht auf andere Gewebetypen wie den soliden Tumor angewendet werden können. Wir haben das Protokoll vereinfacht, um es so benutzerfreundlich wie möglich zu gestalten, aber wie in allen biologischen Studien kann es einige Übungsläufe benötigen, um es zu verwalten. Wenn Sie dies zum ersten Mal tun, können Sie zuerst alle Ihre Reagenzien fertig stellen und dann das Protokoll strikt befolgen.
Wenn Probleme auftreten, können Sie eine Verbindung zum CyTOForum herstellen und mit anderen CyTOF-Benutzern sprechen, die Ihnen bei der Fehlerbehebung helfen können. Bei der biologischen Probenvorbereitung können einfache Tricks mit dem Endergebnis einen großen Unterschied machen. Eine visuelle Demonstration ist für einen neuen Benutzer viel einfacher, das Protokoll zu erfassen.
Wenn Sie dies zum ersten Mal tun, können Sie Ihre Reagenzien zuerst fertig stellen und dann strikt dem Protokoll folgen. Für die Knochenmarkernte eine sechs bis zehn Wochen alte C57 schwarze Sechsmaus in die Supine-Position auf einem sterilen chirurgischen Pad legen und 70% Ethanol verwenden, um den Bauch und die Hinterbeine zu sterilisieren. Verwenden Sie eine sezierende chirurgische Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Haut zu entfernen, um die Hinterbeine freizulegen.
Halten Sie die Maustibia mit einem Paar stumpf gekippten Anreifungszangen direkt unter dem Knöchel und verwenden Sie ein Paar gekrümmte Verbandszangen, um die Tibia unter den stumpf gekippten Anreifungszangen zu stabilisieren. Verwenden Sie die stumpf gekippten Anziehzange, um die Tibia zu brechen und den Muskel zu entfernen, um den Knochen freizulegen. Bevor Sie die Tibia in kalteS PBS legen, bewegen Sie die stabilisierenden gekrümmten Verbandszangen zum Oberschenkelknochen und schieben Sie die stumpf gekippten Verbandszangen unter das Kniegelenk, um die Kniescheibe zu halten.
Ziehen Sie vorsichtig nach oben, um die Kniescheibe zu verrenken und entfernen Sie den Muskel von der Kniescheibe, um den Oberschenkelknochen freizulegen. Halten Sie den freiliegenden Oberschenkelknochen durch die gekrümmten Verbandszangen und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Oberschenkelknochen von der Unterseite des Knochens zu schneiden. Legen Sie dann den Oberschenkelknochen in PBS.
Als nächstes verwenden Sie eine 18-Spur-Nadel, um ein Loch in ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu schlagen und legen Sie beide Knochen in das Rohr mit den offenen Enden der Knochen nach unten in das Loch. Legen Sie das 0,5-Milliliter-Rohr in ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie die doppelschichtigen Rohre in einer Mikrozentrifuge. Bestätigen Sie am Ende der Zentrifugation, dass das Knochenmark an den Boden des Rohres extrahiert wurde.
Um die Knochenmarkzellen für die Massenzytometrie zu färben, setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter roter BlutkörperchenLysepuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur wieder auf. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter kalten PBS wieder aufhängen. Filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 15 Milliliter konisches Rohr und waschen Sie die Zellen mit neun Millilitern frischer, kalter PBS.
Setzen Sie das Knochenmarkzellpellet in 10 Milliliter frischer, kalter PBS zum Zählen wieder auf und übertragen Sie fünfmal 10 in die sechste Zelle aliquot in eine neue 15 Milliliter-Röhre. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Massenzytometrie-Färbungspuffer, ergänzt durch 125 Nanomolar Cisplatin. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen in vier Milliliter frischer Massezytometriepuffer waschen.
Das Pellet in 50 Mikroliter FC-Rezeptor-Blockierlösung wieder aussetzen. Nach 10 Minuten bei vier Grad Celsius 50 Mikroliter des von Interesse sindden Antikörpercocktails in die Zellen geben und sanft pfeifen, um sie zu mischen. Die Temperatur in verschiedenen Inkubationsschritten ist sehr wichtig, um die Lebensfähigkeit der Knochenmarkzellen zu erhalten.
Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen zweimal in zwei Millilitern frischer Massezytometriepuffer pro Wäsche waschen, bevor die Zellen in einem Milliliter frisch zubereitetem 1,6%Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur wieder aufgesetzt werden. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter festen Permpuffer sanieren, ergänzt mit 125 nanomolaren Interkalationslösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius. Vor der Analyse der Zellen durch Massenzytometrie, sanft Wirbel und Zentrifugieren der Zellsuspension vor dem Waschen der Zellen in zwei Milliliter frische Masse Zytometrie Färbung Puffer.
Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal in einem Milliliter destilliertem Wasser pro Wäsche, sorgfältig aspirating der Überstand nach der zweiten Wäsche, bevor sie die Zellen wieder auf einmal 10 bis sechs Liter Pro Milliliter Masse Zytometrie Pufferkonzentration für Masse Zytometrie-Analyse. In diesem T verteilten stochastischen Einbettungsdiagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, gemessen durch ein 33-Parameter-Massenzytometrie-Panel, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlicheren Eigenschaften wurden automatisch basierend auf der Ausprägung dieser Marker auf jeder Zelle gruppiert.
Mit dieser Methode wurde die Integrität des gesamten Knochenmarks erhalten, was zur Entdeckung einer bisher unbekannten Zellpopulation führte, die gleichzeitig neutrophilund hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen mitdrückt. Diese Zellpopulation, die zuvor in myeloischen Vorläuferstudien aufgrund der ly6G-positiven Zellerschöpfung weggelassen wurde, weist ein deutliches Muster der Oberflächenmarkerexpression auf. Noch wichtiger ist, dass diese Daten zur Entdeckung einer kleinen Teilmenge des Ly6G-positiven Zellclusters führten, die Ly6G nicht ausdrückt, aber eng an die CD117-positiven Ly6G-positiven Zellen gruppiert wurde, was auf die Ähnlichkeit dieser Zellen mit der Neutrophilen-Linie auf der Grundlage der Expression der 33 Oberflächenmarker hindeutet, die in diesem Massenzytometrie-Experiment verwendet werden.
Eine 13 Farbfloreszenz aktivierte Zellsortierung Panel könnte dann gebaut werden, so dass die Isolierung der neutrophilen Vorläufer durch Durchflusszytometrie für nachgeschaltete funktionelle Assays. Es ist wichtig, den Knochenmark-Isolationsverfahren so schnell wie möglich durchzuführen und die Zellen während des Färbevorgangs bei vier Grad Celsius zu halten.
