이 질량 세포 측정 프로토콜은 전체 골수의 무결성을 보존하여 연구 된 세포의 분석을위한 기존의 샘플 준비 중에 손실 된 정보를 구출 할 수 있습니다. 이 빠르고 수월한 골수 격리 프로토콜은 희귀 호중구 계보 계보 서브셋과 같은 실행 가능한 단명 골수성 세포 집단의 획득을 용이하게합니다. 호중구 계보 세포와 같은 평가된 면역 세포에서 이전에 식별하기 위해 질량 세포 측정을 사용하면 다양한 질병에 대한 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.
이 프로토콜은 골수에 존재하는 짧은 수명 골수세포의 무결성을 보존하고 고형 종양과 같은 다른 조직 유형에 쉽게 적용될 수 있다. 우리는 가능한 한 사용자 친화적 인 있도록 프로토콜로 단순화, 하지만 모든 생물학적 연구에서와 같이 그것은 관리하기 위해 몇 가지 연습 실행이 필요할 수 있습니다. 이 작업을 처음 수행 할 때 모든 시약을 먼저 준비한 다음 프로토콜을 엄격하게 따를 수 있습니다.
문제가 발생하면 CyTOForum에 연결하고 문제 해결을 도울 수 있는 다른 CyTOF 사용자와 대화할 수 있습니다. 생물학적 샘플 준비를 위해 간단한 트릭은 최종 결과와 큰 차이를 만들 수 있습니다. 시각적 데모는 새 사용자가 프로토콜을 쉽게 파악할 수 있습니다.
이 작업을 처음 수행하는 경우 시약을 먼저 준비한 다음 프로토콜을 엄격히 따를 수 있습니다. 골수 수확의 경우, 멸균 수술 패드에 수핀 위치에 6-10 주 된 C57 블랙 6 마우스를 놓고 70 %에탄올을 사용하여 복부와 뒷다리를 살균하십시오. 해부 수술 가위 한 켤레를 사용하여 복강을 열고 피부를 제거하여 뒷다리를 노출시하십시오.
무딘 팁 드레싱 포셉 을 사용하여, 발목 바로 아래 마우스 경골을 잡고 무딘 팁 드레싱 집게 아래 경골을 안정화곡선 드레싱 집게의 쌍을 사용합니다. 무딘 팁 드레싱 집게를 사용하여 경골을 부러뜨리고 근육을 제거하여 뼈를 노출시하십시오. 차가운 PBS에 경골을 넣기 전에 안정화 곡선 드레싱 집게를 대퇴골에 옮기고 무릎 관절 아래에 무딘 팁 드레싱 포셉을 밀어 무릎을 꿇습니다.
슬개골을 부드럽게 당기고 슬개골에서 근육을 제거하여 대퇴골을 노출시합니다. 구부러진 드레싱 집게에 의해 노출 된 대퇴골을 잡고 수술 가위를 사용하여 뼈 바닥에서 대퇴골을 자른다. 그런 다음 대퇴골을 PBS에 배치합니다.
다음으로, 18 게이지 바늘을 사용하여 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 구멍을 뚫고 두 뼈를 구멍으로 아래쪽으로 향하는 열린 끝과 함께 튜브에 두 뼈를 배치합니다. 0.5 밀리리터 튜브를 1.7 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 이중 층 튜브를 마이크로 원심분리기에서 회전시합니다. 원심 분리의 끝에서, 골수가 관의 바닥에 추출되었는지 확인합니다.
대량 세포측정을 위해 골수 세포를 염색하기 위해 실온에서 10 분 동안 적혈구 용해 버퍼의 1 밀리리터에서 골수를 다시 중단하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 감기 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 70 마이크로미터 여과기를 통해 15밀리리터 원추형 튜브로 세포를 걸러내고 9밀리리터의 신선하고 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오.
다시 계산하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 여섯 번째 세포 알리쿼트에 다섯 번 10을 전송하기위한 신선한, 차가운 PBS의 10 밀리리터에서 골수 세포 펠릿을 일시 중단합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 125 나노 몰라 시스플라틴으로 보충 질량 세포피떨림 염색 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 실온에서 5 분 후, 신선한 질량 세포 분석 버퍼의 네 밀리리터에 세포를 씻어.
FC 수용체 차단 용액의 50 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 섭씨 4도에서 10분 후, 50마이크로리터의 항체 칵테일을 세포에 넣고 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요. 다른 잠복기 단계의 온도는 골수 세포의 생존가능성을 보존하는 데 매우 중요합니다.
섭씨 4도에서 30분 후, 세척당 신선한 질량 세포측정 버퍼 2밀리리터로 세포를 2회 세척한 후 실온에서 15분 동안 1밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 4섭씨에서 하룻밤 배양을 위한 125 나노몰러 상호 작용 용액으로 보충된 고정 파마 버퍼의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 질량 세포측정에 의해 세포를 분석하기 전에, 신선한 질량 세포피성 염색 버퍼의 2밀리리터에서 세포를 세척하기 전에 세포를 부드럽게 소용돌이 및 원심분리.
다음으로, 세척당 증류수 1밀리리터로 세포를 2회 세척하고, 질량 세포 분석 분석을 위해 질량 세포분석 버퍼 농도의 밀리리터당 10~6세포에서 세포를 다시 중단하기 전에 두 번째 세척 후 상체를 조심스럽게 흡입한다. 이 T 분산 스토샤스 인접 포함 플롯에서, 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33 파라미터 질량 세포측정패널에 의해 측정된 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 하위 집합으로 클러스터되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 셀에 있는 이 마커의 발현에 근거하여 자동으로 함께 클러스터되었습니다.
이 방법을 사용하여, 전체 골수의 무결성이 보존되어 호중구 및 조혈 줄기 및 전구 세포 서명 표면 마커를 동시에 동시 표현하는 이전에 알려지지 않은 세포 집단의 발견으로 이어졌습니다. 이전에 골수성 전구 연구에서 생략되었던 이 세포 인구는 Ly6G 양성 세포 고갈로 인해 표면 마커 발현의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 더 중요한 것은, 이들 데이터는 Ly6G를 발현하지 않는 Ly6G 양성 세포 클러스터의 작은 하위 집합의 발견으로 이어졌지만, CD117 양성 Ly6G 양성 세포에 밀접하게 군집되어, 이 질량 세포 실험에 사용되는 33개의 표면 마커의 발현에 기초하여 호중구 계보와 이들 세포의 유사성을 시사한다.
13색 플로레시엔스 활성화 셀 선별 패널을 구축하여 다운스트림 기능 분석용 세포측정을 통해 호중구 선조의 분리를 가능하게 한다. 가능한 한 빨리 골수 격리 절차를 수행하고 염색 절차 동안 섭씨 4도에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다.
