Este protocolo de citometria em massa preserva a integridade de toda a medula óssea, permitindo o resgate das informações que foram perdidas durante a preparação convencional da amostra para análise de células estudadas. Este protocolo rápido e sem esforço de isolamento da medula óssea facilita a aquisição de populações viáveis de células mielóides de curta duração, como subconjuntos raros de linhagem de neutrófilos. O uso da citometria em massa para identificar células imunes anteriormente apreciadas, como células de linhagem de neutrófilos, pode ter amplas implicações para uma grande variedade de doenças.
Este protocolo preserva a integridade das células mielóides de curta duração que estão presentes na medula óssea e podem ser facilmente aplicadas a outros tipos de tecidos, como o tumor sólido. Simplificamos o protocolo para torná-lo o mais amigável possível, mas como em todos os estudos biológicos pode precisar de algumas práticas para gerenciar. Quando você está fazendo isso da primeira vez, você pode obter todos os seus reagentes pronto primeiro e, em seguida, seguir estritamente o protocolo.
Se você tiver algum problema, você pode se conectar ao CyTOForum e conversar com outros usuários do CyTOF que podem ajudar a solucionar problemas. Para a preparação biológica da amostra, truques simples podem fazer uma enorme diferença com o resultado final. Uma demonstração visual é muito mais fácil para um novo usuário entender o protocolo.
Se você está fazendo isso pela primeira vez, você pode obter seus reagentes prontos primeiro e, em seguida, seguir estritamente o protocolo. Para a colheita da medula óssea, coloque um rato preto C57 de seis a 10 semanas de idade na posição supina em uma almofada cirúrgica estéril e use 70% de etanol para esterilizar o abdômen e os membros traseiros. Use um par de tesouras cirúrgicas dissecando para abrir a cavidade abdominal e remover a pele para expor os membros traseiros.
Usando um par de fórceps de ponta sem corte, segure a tíbia do rato logo abaixo do tornozelo e use um par de fórceps curvos para estabilizar a tíbia abaixo dos fórceps de curativos com pontas bruscas. Use os fórceps de ponta sem corte para quebrar a tíbia e remova o músculo para expor o osso. Antes de colocar a tíbia no PBS frio, mova os fórceps curvados estabilizadores para o fêmur e deslize os fórceps de curativos de ponta sem corte abaixo da articulação do joelho para segurar a rótula.
Puxe suavemente para cima para deslocar a rótula e remova o músculo da rótula para expor o fêmur. Segure o fêmur exposto pelos fórceps curvos e use uma tesoura cirúrgica para cortar o fêmur da parte inferior do osso. Em seguida, coloque o fêmur na PBS.
Em seguida, use uma agulha de calibre 18 para perfurar um buraco em um tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitro e coloque ambos os ossos no tubo com as extremidades abertas dos ossos voltados para baixo no buraco. Coloque o tubo de 0,5 mililitro em um tubo de micro centrífuga de 1,7 mililitro e gire os tubos de duas camadas em uma micro centrífuga. No final da centrifugação, confirme que a medula óssea foi extraída para o fundo do tubo.
Para manchar as células da medula óssea para citometria em massa, suspenda novamente a medula óssea em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, recolhe as células por centrifugação e suspende a pelota em um mililitro de PBS frio. Filtre as células através de um coador de 70 micrômetros em um tubo cônico de 15 mililitros e lave as células com nove mililitros de PBS fresco e frio.
Suspender a pelota da célula de medula óssea em 10 mililitros de PBS fresco e frio para contar e transferir uma taxa de cinco vezes 10 para a sexta célula aliquot em um novo tubo de 15 mililitros. Coletar as células por centrifugação e suspender as células em um mililitro de tampão de coloração de citometria em massa, complementado com 125 cisplatina nanomolar. Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, lave as células em quatro mililitros de tampão de citometria de massa fresca.
Suspenda a pelota em 50 microliters da solução de bloqueio do receptor FC. Após 10 minutos a quatro graus Celsius, adicione 50 microliters do coquetel de anticorpos de interesse às células e cano suavemente para misturar. A temperatura em diferentes passos de incubação são muito importantes na preservação da viabilidade das células de medula óssea.
Depois de 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células duas vezes em dois mililitros de tampão de citometria de massa fresca por lavagem antes de suspender as células em um mililitro de formaldeído recém-preparado por 15 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, colete as células por centrifugação e suspenda a pelota em um mililitro de tampão perm fixo complementado com 125 solução de intercalação nanomolar para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Antes de analisar as células por citometria de massa, vórtice suavemente e centrífuga a suspensão celular antes de lavar as células em dois mililitros de tampão de coloração de cytometria de massa fresca.
Em seguida, lave as células duas vezes em um mililitro de água destilada por lavagem, aspirando cuidadosamente o supernascido após a segunda lavagem antes de suspender as células em uma vez 10 a 6 células por mililitro de concentração de tampão de citometria em massa para análise de citometria em massa. Neste t distribuído enredo de incorporação estocástica, as células através de múltiplos tecidos de camundongos foram agrupadas em subconjuntos com base na similaridade de seus perfis de expressão de marcadores de superfície medidos por um painel de citometria de massa de 33 parâmetros. Células com propriedades mais semelhantes foram automaticamente agrupadas com base na expressão desses marcadores em cada célula.
Usando este método, a integridade de toda a medula óssea foi preservada, levando à descoberta de uma população celular até então desconhecida que simultaneamente co-expressa neutrófilo e tronco hematopoiético e células progenitoras assinatura marcadores de superfície. Essa população celular, que foi anteriormente omitida em estudos progenitores mieloides, devido ao esgotamento positivo das células Ly6G, apresenta um padrão distinto de expressão de marcador de superfície. Mais importante, esses dados levaram à descoberta de um pequeno subconjunto do aglomerado celular positivo Ly6G que não expressa Ly6G, mas foi agrupado de perto às células positivas ly6G do CD117, sugerindo a semelhança dessas células com a linhagem de neutrófilos com base na expressão dos 33 marcadores de superfície usados neste experimento de citometria em massa.
Um painel de classificação celular ativado de 13 cores poderia então ser construído, permitindo o isolamento dos progenitores neutrófilos por citometria de fluxo para ensaios funcionais a jusante. É importante realizar o procedimento de isolamento da medula óssea o mais rápido possível e manter as células a quatro graus Celsius durante o procedimento de coloração.
