Unser Protokoll für einen in vitro transkribierten RNA-basierten Luziferase-Assay hilft, die Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht eine kundenspezifische Länge des Poly(A)Liters das Studium seiner regulatorischen Auswirkungen auf die Übersetzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Übersetzungsregulierung durch Cis-Elemente wie 5'UTR und 3'UTR in mRNA und ein breites Spektrum der Übersetzungsinitiierung ermöglicht.
Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luziferase-Reporter-Assay kann auf Modifikationen an Kappen und andere Modifikationen zugeschnitten und verwendet werden, um die Wirkung auf die Übersetzung zu testen. Entwerfen Sie zunächst Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, um PCR-Amplikon zu erzeugen, das die folgenden Elemente in 5'bis 3'Richtung enthält:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF in einem Poly(A)tail, der als T7_12A-Fluc bezeichnet wird, enthalten mehrere zusätzliche Nukleotide in Vordergrundung, gefolgt von T7-Promoter Poly(A)liter oder gewünschter 5'UTR-Sequenz und etwa 20 Nukleotiden, die dem 5'Ende des ORF des Reportergens entsprechen. Passen Sie die Grundierungslänge basierend auf der Schmelztemperatur an, die dem 5'Ende des ORF des Reportergens entspricht, um sicherzustellen, dass die entsprechende Region im Primer mit dem Sinnesstrang des Gens identisch ist.
Dann entwerfen Reverse Primer Poly(A)tail und ca. 20 Nukleotide. Passen Sie basierend auf der Schmelztemperatur entsprechend dem 3'Ende des ORF des Reportergens an, um sicherzustellen, dass der entsprechende Bereich des Primers mit dem Antisensestrang des Gens identisch ist und vor dem Poly(A)tail ein In-Frame-Stop-Codon vorhanden ist. Für die interne Kontrolle einen weiteren Satz von Primern entwerfen, die die folgenden Elemente in 5'bis 3'Richtung enthalten:T7-Promoter, eine zufällige 5'UTR-Codierungssequenz mit Kozak-Sequenz, Renilla Luciferase ORF und Poly(A)tail, genannt T7_Kozak-Rluc.
Um die Reaktion einzurichten, fügen Sie Reagenzien in folgender Reihenfolge zu einem PCR-Rohr hinzu:DNase freies Wasser, 2X High-Fidelity-DNA-Polymerase, Primer und Sequenz bestätigte Luziferase-Vorlagen-DNA. Nach einem standardmäßigen dreistufigen PCR-Zyklus zur Erzeugung einer DNA-Vorlage, erkennen Sie das PCR-Produkt, indem Sie 5-10% der PCR-Reaktion in einer 1%Agarose TAE-Gelelektrophorese zusammen mit einem Molekulargewichtsstandard ausführen. Um die Größe des PCR-Produkts zu bestimmen, visualisieren Sie das Gel unter einem UV-Beleuchtungsgerät.
Nach der Bestimmung der richtigen Größe des PCR-Produkts, reinigen Sie es mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungskit mit 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser, um die DNA zu löschen. Überprüfen Sie die Konzentration der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer und speichern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die Verwendung zur In-vitro-Transkription. Um RNA aus dem PCR-Produkt zu synthetisieren, fügen Sie die folgenden Reagenzien zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu: DNase-RNase freies Wasser, NTP-Puffermix, Cap Analog, PCR-Produktvorlage und T7-RNA-Polymerase-Mix aus In-vitro-Transkriptionskit.
Mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden und gehen Sie dann mit einem RNA-Reinigungskit zur Reinigung der synthetisierten RNA über. Um die gereinigte RNA zu überprüfen, erhitzen Sie RNA bei 70 Grad für fünf Minuten, um sekundäre Struktur zu entfernen und führen Sie sie auf 1,5 Agarose TBE Gel.
Dann visualisieren Sie das Gel unter einem UV-Beleuchtungsgerät. Überprüfen Sie die Konzentration der gereinigten RNA mit einem Spektralphotometer. Aliquot it und lagern bei minus 80 Grad Celsius.
Saat-HeLa-Zellen in einer 24-Well-Platte, um 80-90%konfluency am nächsten Tag zu erreichen und über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid zu brüten. Infizieren Sie HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf und halten Sie nicht infizierte HeLa-Zellen zum Vergleich. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 10 bis 12 Stunden.
Mischen Sie nach der gewünschten Stunde nach der Infektion 480 Nanogramm 12A Sequenz mit Firefly Luciferase mRNA und 20 Nanogramm Kozak-Sequenz mit Renilla Luciferase mRNA in einem Mikrozentrifugenrohr. In einem anderen Mikrozentrifugenrohr 1,1 Mikroliter kationisches Lipidtransfektionsreagenz hinzufügen. 55 Mikroliter reduzierter Serummedien in beide Röhren geben, bei Raumtemperatur fünf Minuten mischen und inkubieren.
Fügen Sie dann 55 Mikroliter kationisches Lipidtransfektionsreagenz, das reduzierte Serummedien enthält, zu mRNA-haltigem Röhrchen hinzu. Mit einer Pipette sanft, aber gründlich mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Während der Inkubation, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den Zellen und fügen Sie 400 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Brunnen hinzu.
Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung fallen weise und gleichmäßig pro Brunnen der 24 Brunnenplatte. Fünf Stunden nach der Ko-Transfektion mit 12A Fluc und Kozak Rluc mRNA, entfernen Sie das reduzierte Serummedium aus den Zellen und lyse die Zellen durch Zugabe von 150 Mikroliter nx Lysepuffer aus dem Luciferase-Assay-Kit, das in der Lage ist, zwei Reporter-Assays durchzuführen. Nach der Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur, kratzen Sie die Zellen mit Gummi und sterile Spritze und übertragen Sie in ein Mikrozentrifugenrohr.
Um Zellreste zu pellet, zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 30 Mikroliter Überstand pro Brunnen einer undurchsichtigen wandweißen 96 gut weißen Assayplatte mit einem soliden Boden. Verwenden Sie das Luciferase-Assay-Kit und ein Multimode-Plattenleser-Luminometer, um die doppelte Lumineszenz mit der im Manuskript beschriebenen Kinetikfunktion zu messen.
Nach dem Export der Lumineszenz-Lesedaten in ein wünschenswertes Dateiformat, bestimmen Sie die relative Translationsrate von 12A Fluc mRNA in nicht infizierten und VACV-infizierten HeLA-Zellen, indem Sie den Fluc-Wert durch den internen Kontroll-Rluc-Wert dividieren. Dieser Test wurde verwendet, um die Translationseffizienz einer Fluc mRNA zu testen, die einen 5'Poly(A)Liter in nicht infizierten und VACV-infizierten Zellen enthält. Sowohl nicht infizierte als auch VACV-infizierte Zellen wurden erfolgreich mit Fluc und Rluc mRNA kotransfiziert.
Die Division von Fluc durch Rluc normalisierte die Transfektionseffizienz in der RNA-Stabilität in Zellen. 5'Poly(A)liter mRNA hat einen translationalen Vorteil während der VACV-Infektion im Vergleich zu nicht infizierten Zellen. Dies war nicht auf die Differenztransfektionseffizienz oder mRNA-Stabilität zurückzuführen, da der RNA-Spiegel bei nicht infizierten und VACV-infizierten Zellen fünf Stunden nach der mRNA-Transfektion ähnlich war.
Achten Sie bei der Konstruktion von Primern besonders darauf, da dies nicht nur die Effizienz der PCR-Reaktion, sondern auch alle nachgelagerten Prozesse beeinflussen kann, die die verstärkte DNA erfordern. Diese Methode ist ein wichtiger Test, um die Übersetzungsregelung durch Cis-Elemente schnell zu testen. Wenn möglich, sollte diese Methode durch andere ergänzende Experimente bestätigt werden.
Vorsicht sollte bei der Verwendung des Vaccinia-Virus getroffen werden und die Exposition gegenüber Chemikalien wie Ethidiumbromid und Phenol vermieden werden.
