Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Proben, die erhalten Luciferase-exprimierenden Virus (hierin VSVΔ51-Fluc als Beispiel) für die Titration und Übertragung in 96-Well-Platten. Alternativ führen Infektionen in 96-Well-Gewebekulturplatten und Nutzung Ständen direkt. </li><li> Verlassen zwei Säulen unbehandelt für die Aufnahme von Standardkurven. Für Experimente direkt in 96-Well-Platten,-Titer am Ende des Experiments (40 h nach Infektion) oder bei -80 ° C und Titer zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen. </li></ol> 2. Herstellung von permissiven Zellen für Virustitration <ol><li> 24 Stunden vor der Titrierung Eine Suspension von Vero-Zellen bei einer Konzentration von 2,5 x 10 5 Zellen / ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 30 mM HEPES und 1% Penicillin / Streptomycin. HINWEIS: Dieses Protokoll Vero-Zellen verwendet, kann jede geeignete permissive Zelllinie für die VSV-Infektion be verwendet. </li><li> Saatgut 2,5 x 10 4 Zellen (100 ul) in 96-Well-weißer Feststoff-Flachbodenplatten unter Verwendung eines Mikrospender. <ol><li> Bereiten Sie 12 ml Zellsuspension pro Platte plus 5 ml zur Grundierung. </li><li> Saubere Mikrospender Kassette durch Spülen der Rohrleitung mit 50 ml sterilem Wasser. </li><li> Füllen Sie die Mikrospender Linien mit Zellsuspension und lassen 5 ml Zellsuspension durch fließen. </li><li> Wählen Sie ein Programm, das 100 ul in jede Vertiefung einer weißen Mauern 96-Well-Platte verzichtet werden. Verzichtet werden, und wiederholen Sie nach Bedarf für zusätzliche Platten. Saatgut auch ein paar Vertiefungen in einer 96-Well-Flachboden klar Platte, wenn undurchsichtige Boden weißen Mauern Platten werden zur Überprüfung der Zellgesundheit und Dichte verwendet. </li><li> Wenn Sie fertig sind, spülen Zellen wieder in Originalbehälter. Reinigen der Kassette laufen 50 ml 70% Ethanol, gefolgt von 50 ml warmem sterilem Wasser durch die Rohrleitung. </li><li> Stellen Sie sicher, Kassette und Schläuche sind appropriately zwischen den Anwendungen zu reinigen. </li></ol></li><li> Zellen für 24 h bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator. </li></ol> 3. Herstellung von Viral Standardkurve <ol><li> Vorbereitung einer Standardkurve von VSVΔ51-Fluc in Serum-freiem DMEM, so dass die Endkonzentration des Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml nach Transfer auf Vero-Zellen ist wie folgt: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 PBE / ml, und 10 1 pfu / ml. Bereiten Sie 50 ul jeder Konzentration pro Platte von Vero-Zellen sowie eine zusätzliche 10%. HINWEIS: Titer des Luciferase-Virus Lager müssen in einem klassischen Weg 10, um eine Standardkurve, die zur absoluten Quantifizierung ermöglicht erzeugen bewertet werden. Ansonsten relative Quantifizierung kann ohne genaue Titer Informationen willkürlich Einstellung virale Titer erreicht werden kannauf Verdünnungsschritte. Beispielsweise die erste Verdünnung der Standardkurve kann bis zu 10 8 Viruseinheiten und der folgenden Verdünnung 1:10 bis 10 7 und so weiter eingestellt werden. In diesem Zusammenhang sollte man Werte als-fache Veränderung gegenüber einer vorbestimmten Probe als eine absolute Quantifizierung ist nicht genau auszudrücken. </li></ol> 4. Übertragung der Probe auf Überstände permissiven Zellen <ol><li> Überprüfen Vero-Zellen in der klaren Boden 96-Well-Platte unter einem Lichtmikroskop überzogen, um zu bestätigen, dass Monoschichten sind mindestens 95% konfluent. </li><li> Transfer 25 ul Probe Stand auf Vero-Zellen in der weißen Wandplatten ausgesät. Überstände in die 2 Spalten für Standardkurven bezeichnet nicht übertragen. HINWEIS: Dies kann gleichzeitig für alle Vertiefungen auf einer einzigen Platte mit einem 96-Kanal-Liquid Handler erfolgen. </li><li> Verwendung einer 8 oder 12-Kanal-Multi-Kanal-Pipette, fügen Sie 25 ul jeder Verdünnung der Standardkurve in Schritt 3 auf die Vero-Zellen hergestellt inDie 2 bezeichneten Spalten. </li><li> Zentrifuge Platten für 5 min bei 430 · g bei RT. </li><li> Inkubation für 5 h bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator. </li></ol> 5. Bewertung der Lebensfähigkeit der Zellen <ol><li> HINWEIS: Wenn ausgehend von Überständen von Infektionsversuche in klaren 96-Loch-Platten durchgeführt erhalten, können Proben Lebensfähigkeit vor der Quantifizierung mit einer Lebensfähigkeit der Zellen beurteilt werden Indikatorfarbstoff wie Resazurin. </li><li> Hinzufügen Resazurin in einer Menge gleich 10% des Volumens in jedem Well der 96-Well-Platte der Proben Virus und Zellen enthält. Schließen Zell nur steuert sowie Medien-Kontrolle nur, um Werte für 100% und 0% Lebensfähigkeit bzw. zu bestimmen. </li><li> Nach 2-4 Stunden (Inkubationszeit je nach Zelltyp und von der Konzentration der im Handel erhältlich oder rekonstituierte Pulver des Farbstoffes kann variieren), lesen und notieren Sie die Signal mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät (530-560 Anregung, 590 Emission). Bericht Zelle viability für eine Probe nach der Formel Relative Stoffwechselaktivität = ((Test Probensignal - negativen Steuersignal) / (Cell nur das Steuersignal - negativen Steuersignal)) x 100% </li></ol> 6. Vorbereitung des Luciferinsubstrat <ol><li> 30 min vor dem Ende der 5-stündigen Inkubation bereiten Luciferin, eine 2 mg / ml Lösung in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) erhalten. Bereiten Sie 2,5 ml pro Platte plus ein extra 2 ml. Schutz-Lösung von Licht. Hinweis: Das Luciferin kann auch früher am Tag hergestellt und bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 7. Lesen Biolumineszenz <ol><li> Nach 5 h Inkubation werden 25 ul Luciferin zu jeder Vertiefung der Vero-Zellen in den weißen Festplatten. Hinzufügen Luciferin manuell oder mit einem automatischen Spender im Luminometer integriert. HINWEIS: Die Verwendung von einem Gerät mit nur Einzel-und Endpunkt liest kann die Zugabe eines Luciferase-kompatibel Lyse buf erforderlichfer vor der Zugabe des Luciferin-Substrat, um die Konsistenz zu verbessern. </li><li> Lesen Sie die Platten mit den folgenden Parametern: <ol><li> 5 Sekunden schütteln. </li><li> Warten Sie 30 Sekunden. </li><li> Lesen Lumineszenz bei einer entsprechenden Fest Empfindlichkeit / Belichtungswert. Wenn die Option auf dem Gerät verfügbar ist, verwenden Multi-Point liest (zB 3 x 3-Matrix), um die Genauigkeit zu verbessern. </li></ol></li><li> Notieren und die Intensität quantifiziert Biolumineszenz. </li><li> Wenn ein automatisierter Spender wurde verwendet, um hinzuzufügen Luciferin spülen Luciferin und Minister die Linien mit warmem sterilem Wasser. </li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Für genaue Ergebnisse, löst das nicht-lineare Regression, um eine Hill-Gleichung aus den Standardkurven zu erzeugen. Wenden Sie diese Gleichung, um die Proben titriert viralen Expressionseinheiten zu berechnen. Einige Viren oder Situationen kann eine Standardkurve mit einer linearen Beziehung herzustellen; in diesem Fall löst für eine lineare Gleichung. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die hier beschriebene Luciferase basierenden Ansatz bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden Methoden einschließlich der Leichtigkeit, Schnelligkeit, Minimalausstattung notwendig und relativ niedrigen Kosten. Ein wichtiger Beitrag dazu ist die Vermeidung eines Verdünnungsschritt. Dennoch sind Verdünnungsbasierte Derivate dieses Protokoll sicherlich möglich und wurden vor kurzem zur Luciferase-exprimierenden Ebola-Titer in einem Hochdurchsatz-Antivirus-Bildschirm von 11 zu bewerten. Während naturgemäß zeitaufwändig und teurer, können solche Anpassungen größeren Dynamikbereich für die virale Quantifizierung bieten, wenn nötig. Zusätzlich dazu, dass sich besonders gut zur Auswertung Virustiter im Rahmen der Hochdurchsatz geeignet ist, erzeugt unser Ein-Schritt-Luciferase-basierte virale Quantifizierungsverfahren genaue Schätzungen von infektiösen Virionen bei der Replikation von Viren. Weiterhin Auslesungen der Lumineszenz mit Zytotoxizität von demselben Experiment ergeben einvollständiges Bild der Wirkung der Versuchsbedingungen auf Zielzellen, die besonders nützlich im Zusammenhang mit der onkolytischen Viren und Drogen-Bildschirme ist. Das hier dargestellte Beispiel wird eine Replikation von negativen Einzelstrang RNA-Virus; Jedoch kann dieses Protokoll auf eine Anzahl von replizierenden und nicht-replizierende Viren mit einigen geringfügigen Anpassungen Protokoll angepasst werden. Dazu gehören DNA-Viren, wie Vaccinia, HSV und AAV (siehe Abbildung 5). Proben mit intrazelluläre Viren, wie Vaccinia-Virus infiziert sind beispielsweise, eine Virentrennschritt vor der Quantifizierung (zB mindestens einem Gefrier-Auftau-Zyklus). Bei der Anwendung dieser Technik auf andere Viren, ist es notwendig, die Reaktionszeit von der Übertragung des viralen Überstand oder Lysat, um das Lesen der Platten durch das Luminometer zu optimieren. Dieser Parameter wird in erster Linie auf der Replikationszyklus des Virus in der permissiven Zelllinie und der Stärke der p hängenromoter Fahr Luciferase-Expression. Dies geschieht am besten mit Hilfe der Standardkurve voll in die Optimierung Schritt getan. Um dies zu tun, muß man die entsprechende permissive Zellinie mit verschiedenen Wiederholungen des hergestellten Standardkurve zu infizieren und zu lesen jede Wiederholung bei einer verschiedenen Zeitpunkten nach der Übertragung. Idealerweise wird eine Inkubationszeit Punkt gewählt, die zu einer linearen Beziehung zwischen log (RLE) und LOG (Titer) führt überspannt den erwarteten Proben Titerbereich. Für VSVΔ51-Fluc ist dies typischerweise von 10 4 pfu / ml bis 10 7 pfu / ml für 5 Stunden Inkubationszeit. Wenn niedrigeren oder höheren Titer von Proben erwartet, kann man einfach mit höheren oder niedrigeren die Inkubationszeit. Alternativ können Proben verdünnt werden, um in dem Bereich viel, wie es typischerweise für ELISA getan fallen. Wie oben erwähnt, ist dieses Verfahren gut geeignet, um hohen Durchsatz Drogen-Bildschirme mit Wirkstoffbibliotheken meisten Schritte können automatisiert durchzuführen. Zellen plattiert efficiently unter Verwendung eines automatisierten Mikroplatten-Dispenser kann die Medikamentenbibliothek unter Verwendung eines 96-Kanal-Handler Flüssigkeit zugegeben werden kann, kann unter Verwendung eines Mikroplatten-Virus Spender zugesetzt, und die Platten gelesen unter Verwendung eines automatisierten Luminometer. Theoretisch kann dies auch für 384er oder kleinere Formate angepasst werden; jedoch die Einschränkung zu diesem Zweck ist die Anzahl der Zellen, die plattiert werden können, da weniger Zellen führt zu einem engeren Bereich in der Linearität der LOG (RLU) bis (Titer) Beziehung Protokoll. Schließlich können Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Resazurin oder andere Stoffwechsel Farbstoffe leicht in den Workflow integriert werden, so dass für die Diskriminierung von zytotoxischen Verbindungen in der antiviralen Bildschirmen oder zur Identifizierung von Verbindungen, die an synergistische Tötung in Kombination mit Viren 12 führen. Dennoch Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen das Erfordernis eines Luciferase-Transgen exprimierenden Virus, was nicht immer möglich ist, und die Verfügbarkeit eines ausreichend permissive Zelllinie. , Wahrscheinlich möglich, anzupassen, ist es jedochVerfahren zur Verwendung mit anderen Reportergene (zB GFP) bereitgestellt Reporter Quantifizierungsverfahren eine geeignete Linearität und das Signal-Rausch-Verhältnis. Insgesamt können die beschriebenen Verfahren mit hohem Durchsatz angepasst werden, um viele verschiedene Viren entsprechen und unterschiedliche Anwendungen zugeschnitten.

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive &#8220;plaquing&#8221; cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9. 
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV&#8710;51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbeccos&#39; Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>NorthBio Inc.</td>
			<td>NBSF-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:136px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEPES</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310-1</td>
			<td style="width:251px;">Prepare a&#160; 1mM solution, pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alamarBlue&#160;</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>BUF012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Luciferin potassium salt</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3917</td>
			<td style="width:251px;">384-well plates can also be used for higher throughput</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy Mx</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>SMTBL</td>
			<td>Monochromator microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquidator96</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>LIQ-96-200</td>
			<td>96 tip manual pipetting system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:136px;">LQR-200F</td>
			<td style="width:251px;">Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microflo</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>111-206-21</td>
			<td>Used to plate cells in a 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5210450</td>
			<td>Microplate fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput titration of luciferase-expressing recombinant viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

Ein Überblick über die Arbeitsweisen durch die Hochdurchsatz-Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse eines typischen Standardkurve ofVSVΔ51-Fluc. Vier-Parameter-nichtlinearen Regressionsanalyse erzeugt eine Hill-Kurve, aus dem unbekannten Eingangs pfu (Schätzung der Virustiter) interpoliert werden kann. Diese geschätzten Titer werden als viralen Expressionseinheiten (VEU). 3A zeigt VEUS und Titer durch Ausführen eines Standard-Plaque-Assay mit den gleichen Proben 10 erhalten. Proben stammten von einem Experiment, in dem verschiedene Chemikalien wurden verwendet, um die Replikation zu erhöhen und von VSVΔ51-Fluc verbreitet in Zellen 786-0. VEUS aus der Standardkurve interpoliert, um einen Faktor, der von der Verdünnung der Probenüberstände beruht zu multiplizieren, die auf Vero-Zellen überführt (in diesem Fall ist der Verdünnungsfaktor 5). Die lineare Korrelation zwischen dem Titer und VEU ist in 3B gezeigt, </strong&gt; Mit einem R 2 von 0,8083 und einer Pearson-r-Score von 0.899 (p &lt;0,0001). In Figur 4 ist typisch Zytotoxizität von Daten von einem metabolischen Assay erhaltenen 786-0 für Zellen mit Chemikalien vor der Infektion mit VSVΔ51-Fluc behandelt gezeigt. Schließlich zeigt 5 typische Standardkurven mit verschiedenen Viren erhalten (Herpes Simplex Virus (HSV), Vaccinia-Virus und Adeno-assoziierte Virus (AAV), die alle exprimierenden Firefly Luziferase) und beschreibt Inkubationszeiten und Gefrier-Auftau-Zyklen, wie gewünscht. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Workflow-Hochdurchsatz-Virus Titerung und Zytotoxizität-Test unter Verwendung VSV Δ 51-Fluc. (A) Samen, 2,5 x 10 4 Vero-Zellen pro Vertiefung (100 ul) und Inkubation bei 37 ° C. (B) 24h später Transfer 25 ul Standardkurve auf Vero-Zellen (2 Spalten pro Platte). (C) Transfer von 25 ul Proben, die auf die verbleibenden Vero-Zellen titriert werden. Zentrifuge Platten und bei 37 ° C. (D) in einer Höhe von 10% des Volumens in die gut, fügen Resazurin Reagenz zu der Platte mit den Originalproben. Platten bei 37 ° C. (E) inkubieren Nach 3 h, lesen und beschreiben und zu bewerten Fluoreszenz Zytotoxizität. (F) Nach 5 h, fügen Sie 25 ul von 2 mg / ml Lösung von Luciferin in jede Vertiefung der Vero-Zellen. Lesen Lumineszenz und berechnen viralen Expressionseinheiten. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Erwartete Standardkurve von VSV Δ 51-Fluc. Mich Luciferaseexpressiongesicherter 5 Stunden nach der Überstand Übertragung an fünf verschiedenen Punkten innerhalb eines gut mit einem Luminometer und Biolumineszenz wurde im mittleren relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben. Bedeuten RLU wurde gegen bekannte Eingangs aufgetragen pfu / ml, die nicht-lineare Regression gelöst und erzeugen eine Hill-Gleichung. Der Durchschnitt von zwei Wiederholungs Kurven und Standardfehlerbalken dargestellt (r 2 = 0,9993). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3 Vergleich von Standard-Plaque-Assay-Titer mit denjenigen von Hochdurchsatz-Verfahren erhalten. (A) Virustiter in pfu / ml durch Standard-Plaque-Assay auf Vero-Zellen erhalten wurden, berechnet die viralen Titer (VEU / ml) aus den gleichen Proben titriert mit der Hochdurchsatz-Luciferase-Assay verglichen. (B) lineare Beziehung zwischen VEU / ml und Titer über Standard-p erhaltenLaque-Assay. Lineare Regressionskurve und der Bestimmungskoeffizient (R 2) dargestellt sind. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Beispiel Lebensfähigkeit. Beispiels Lebensfähigkeit vor der Überstand Übertragung auf Vero-Zellen wurde durch die Bewertung zelluläre metabolische Aktivität mit einem handelsüblichen Resazurin-Lösung bestimmt. Raw Fluoreszenzwerte wurden normalisiert, um die von unbehandelten, nicht infizierten Brunnen. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Erwartete Standardkurven mit HSV, Vaccinia und AAV-Viren. Luciferase-Expression wurde an fünf verschiedenen Punkten innerhalb eines gut mit einem Luminometer gemessen und Biolumineszenz wurde im mittleren rela ausgedrückttive Lichteinheiten (RLU). (A) HSV-Standardkurve wurde auf Vero-Zellen gegeben plattierten 24 Stunden vorher mit einer Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung (100 ul) und die Luciferase-Messung erfolgte 17 h nach der Übertragung überstehende (R 2 = 0,9489, n = 1). Eine Hill-Gleichung wurde durch die Lösung der nicht-linearen Regression erzeugt. (B) Vaccinia-Standardkurve wurde auf Vero-Zellen gegeben plattierten 24 Stunden vorher eine Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung (100 ul) und 2,5 h bei 37 ° inkubiert, C, wonach Luciferase Messungen vorgenommen wurden (R 2 = 0,9892). Eine lineare Gleichung wurde durch die Lösung für die lineare Regression erzeugt. (C) AAV-Standardkurve wurde auf menschlichen Lungenkarzinomzellen (A549) zugegeben plattierten 24 Stunden vorher mit einer Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung (100 ul) und die Luciferase-Mess wurde 24 Stunden nach der Infektion. Eine Hill-Gleichung wurde durch die Lösung der nicht-linearen Regression erzeugt. Die durchschnittlichevon fünf Wiederholungs Kurven und Standardfehlerbalken dargestellt (R 2 = 0,9926).

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High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  Ottawa Hospital Research Institute. This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Serie: High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Forschung

Biologie

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...