Diese Methode wird helfen, Labortechniken zu verstehen und durchzuführen, die notwendig sind, um die Aktivität von zwei microRNA in Lungenkrebszellen in vitro zu identifizieren. Lungenkrebs ist weltweit die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Hier stellen wir Techniken vor, die von grundlegenden Labormethoden bis hin zu komplexeren Protokollen reichen, wie Genexpressionsanalyse und Antikörperprotein microRNA, die speziell zur Identifizierung der Wirkung von microRNA-Aktionen eingesetzt werden.
Die folgenden Methoden helfen uns, wichtige Fragen bezüglich der Wirkung von zwei microRNAs, microRNA 143 und microRNA 506, auf die Regulierung des Zellzyklus in Lungenkrebszellen zu beantworten. Wir präsentieren verschiedene Labortechniken, wie Zelltransfektion, RNA-Extraktion, quantitative Echtzeit-PCR und microRNA-Analyse. Wir hoffen, dass unsere Präsentation dazu beitragen wird, diese Analysen erfolgreich abzuschließen.
Setzen Sie zunächst die kultivierten Zellen in einen geeigneten Kolben, der für die RNA- und Proteinextraktion ausreicht, um die Genexpression mittels qPCR- oder Mikro-Array-Analyse durchzuführen. Dann inkubieren über Nacht mit Medien ergänzt mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent Penicillin Streptomycin. Am nächsten Tag bereiten Sie die microRNA-Probe für die Transfektion vor, indem Sie microRNA 143 und microRNA 506 in Medien mit einer Konzentration von jeweils 100 Nanomolaren verdünnen.
Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und entfernen Sie die Medien. Mit 1x PBS waschen. Alle unbehandelten Steuerelemente enthalten nur unvollständige Medien mit Zellen.
Inkubieren Sie die Zellen mit Transfektionsmedien sechs Stunden lang in einem Inkubator. Entfernen Sie nach sechs Stunden die Medien und ersetzen Sie sie durch vier Milliliter frische, vollständige Medien. Ernten Sie die Zellen nach 24 Stunden und 48 Stunden durch Trypsinisierung.
Als nächstes zweimal mit 1x PBS in jedem Rohr waschen und überstand entfernen. Um die RNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt durchzuführen, frieren Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius ein. Die RNA-Extraktion wurde mit einem RNA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Zuerst entfernen Sie die Rohre von minus 80 Grad Celsius und lassen Sie auftauen. Fügen Sie 300 Mikroliter Lysepuffer und Pipette nach oben und unten, um Zellmembran zu brechen. Fügen Sie gleiches Volumen von 100 Prozent ultrareinem Ethanol hinzu.
Dann gut mischen und in getrennten Spalte platzieren. Zentrifugieren und entfernen Sie den Durchfluss. Fügen Sie 400 Mikroliter Waschen und Puffer und Zentrifuge hinzu, um den Puffer zu entfernen.
Fügen Sie 5 Mikroliter DNAse 1 mit 75 Mikroliter NA-Verdauungspuffer in jeder Probe hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten. Dann waschen Sie die Probe mit 400 Mikroliter RNA-Vorbereitungspuffer. Als nächstes zweimal mit RNA-Waschpuffer waschen.
Fügen Sie nun nukleasefreies Wasser in die Spalte, Zentrifuge und dann sammeln Sie die RNA. Messen Sie die RNA-Konzentration. In diesem Stadium können zwei Mikrogramm RNA-Probe für die RNA-Sequenzierung gesendet werden.
Bereiten Sie die cDNA gemäß dem im Textabschnitt beschriebenen Protokoll mit Thermocycler vor. Bereiten Sie Vorwärts- und Reverse-Primer-Lösungen mit DNAse RNAse-freiem Wasser auf eine Konzentration von 10 Mikromolaren vor. Bereiten Sie einen Master-Mix für jedes Gen vor, das entsprechend der Anzahl der Proben nachgewiesen werden soll.
Für jede cDNA-Probe entspricht die Reaktionsmenge der im Text beschriebenen Tabelle. Platzieren Sie jede Probe in ihren jeweiligen Brunnen. Für qPCR ist es immer gut, ein Excel-Dokument mit 96 Well-Platten-Layout vorzubereiten, um den Überblick über die Proben zu behalten.
Führen Sie für jede Probe und das analysierte Gen ihre Reaktion in Triplicaten oder zumindest Duplikaten durch. Versiegeln Sie die Kunststoffplatte mit einem transparenten, optisch klaren Kunststoffversiegeler. Vermeiden Sie es, die dünne Kunststoffschicht mit den Fingern zu berühren, da dies falschesignale erzeugen kann.
Drehen Sie die Platte schnell, um alle Reagenzien auf den Boden ihrer Brunnen zu mischen. Führen Sie als Nächstes die Probenplatte mit einer quantitativen Echtzeit-PCR-Maschine aus. Abrufen der von der qPCR-Maschine generierten CT-Werte und Analyse der relativen Genexpression.
Transfetiere die Zellen, wie im vorherigen Abschnitt dieses Videos beschrieben. Ernten Sie Zellen aus jeder Probe in separaten, 15 Milliliter sterilen Rohren für die Trypsinisierung. Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS, durch Zentrifugation bei 751G für fünf Minuten, und entfernen Sie dann den Überstand.
Setzen Sie die Palette wieder auf und brechen Sie sie, indem Sie 200 Mikroliter eiskalte 1x PBS durch eine Pipette hinzufügen. Fügen Sie zwei Milliliter 70 Prozent eiskaltes Ethanol, tropfenweise in die Röhre, während wirbeln die Röhre sanft, um die Zellen zu fixieren. Röhren 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und eine Stunde lang in vier Grad Celsius aufstellen.
Entfernen Sie die Rohre von vier Grad Celsius und Zentrifuge. Fügen Sie 2ml eiskalte PBS und Wirbel, und dann entfernen Sie den Überstand durch Zentrifugation. Fügen Sie 500 Mikroliter 1x PBS mit Propidiumjodid und Ribonuklease A mit einer Konzentration von 50 bzw. 200 Mikrogramm pro Milliliter in jeder Probe hinzu und brüten 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Übertragen Sie Proben in geeignete Rohre, schützen Sie vor Licht, und laufen Sie auf Durchflusszytometer. Dieses Experiment soll die expression der Proteine des Zellzykluswegs identifizieren, die durch die microRNA-Behandlung verändert wurden. Sammeln Sie Proteinproben gemäß dem im Transfektionsabschnitt beschriebenen Verfahren und quantifizieren Sie sie mit BCA-Assay.
Entfernen Sie die Dias von minus vier Grad Celsius eine Stunde vor dem Experiment, um Raumtemperatur zu bringen und Feuchtigkeit zu entfernen. Nehmen Sie 70 Mikrogramm Proteinproben und bereiten Sie Probenschlitten gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, die auch Schritt für Schritt im Textabschnitt beschrieben werden. Hier zu beachten, richtige sanieren von Rutschen mit ultra-reinem entionisiertem Wasser ist ein weiterer wichtiger Schritt, da dies helfen wird, den Hintergrund der Dias zu reduzieren.
Darüber hinaus ist es in diesem Experiment sehr wichtig, die Probenrutschen bis zum letzten Schritt nicht auszutrocknen. Scannen Sie schließlich die Folie mit der Micro-Array-Maschine und analysieren Sie die Daten. Die qPCR-Analyse der mit microRNA behandelten Proben erfolgte, um die Genexpression von CDK1, CDK4 und CDK6 zu bestimmen.
Diese Gene regulieren den Zellzyklus von normalen und Krebszellen und wurden als Mittel zur Hemmung der Tumorprogression ins Visier genommen. Die Daten zeigten die downregulatorische Wirkung dieser Gene aufgrund der Behandlung mit microRNA 143 und 506. Zellzyklusverteilungsdaten aus der Durchflusszytometrie zeigten einen Bevölkerungszuwachs in der G0- und G1-Phase und einen Bevölkerungsrückgang in der S-Phase aufgrund der Wirkung der kombinatorischen Behandlung von microRNA 143 und 506.
Die spezifische Mikro-Array-Analyse des Zellzyklus erkannte Proteinexpressionsänderungen von etwa 60 Genen. Die dargestellte Heatmap zeigte eine Downregulation auf dem Proteinniveau mehrerer Gene an, die für das Fortschreiten des Zellzyklus und die Proliferation erforderlich sind, wie CDK2, Helen 1 und 3, RE2F1. Im Gegensatz dazu wurden Proteine, die allgemein durch ihre gewachsene hemmende Wirkung erkannt wurden, hochreguliert.
Obwohl die Ergebnisse semiquantitativ sind und weitere Analysen erforderlich sind, bietet die Mikro-Array-Analyse einen schnellen Überblick über die Aktivität des Pfades. Wir glauben, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos in der Lage sein werden, grundlegende, sowie komplexe Laborexperimente durchzuführen, die Ihnen bei der Identifizierung von microRNA-Aktivitäten in Zellen helfen werden.
