Dieses Protokoll ist wichtig, weil es uns erlaubt, die Mikroumgebung zu visualisieren, in der Zellen ein bestimmtes Zytokin produzieren, hier Interferon-Gamma. Es wird zugegeben, dass der Wirkungsbereich von Zytokinen begrenzt ist, weil Gewebe so komplex sind. Es ist wichtig, die Zellen zu charakterisieren, die Interferon-Gamma-produzierende Zellen umgeben, um festzustellen, welche Zellen sie aufnehmen werden.
Der Hauptvorteil der Technik ist, dass sie die Mikroumgebung im Gewebe von Interesse nicht stört. Da wir Zellen nicht künstlich restimulieren, um sie zu zwingen, Interferon-Gamma zu produzieren, gibt es uns eine bessere Charakterisierung, ob Zellen tatsächlich aktiv Interferon-Gamma vor Ort produzieren. Dieses Protokoll könnte potenziell an andere Organe und für die Visualisierung anderer Zytokine angepasst werden.
Die meisten Schritte in diesem Protokoll sind einfach, aber die Handhabung des Gewebes, Einfrieren und Schnitt, sollte mit Sorgfalt durchgeführt werden, um die Integrität des Gewebes zu erhalten. Um zu beginnen, übertragen Sie 300 Mikroliter LM kultiviert genetisch verändert, um OVA in eine Brühe Herzinfusion bei 37 Grad Celsius in einem Kolben ausgedrückt. Legen Sie den Kolben auf einen Shaker für sanfte Sergung, um LM zu einer exponentiellen Phase zu wachsen, bis der OD600 0,08 bis 0,1 erreicht.
Nach der Verdünnung der LM OVA-Kultur in PBS auf eine Konzentration von 0,1-fach tödlicher Dosis verwenden 50 % eine Insulinspritze mit 29 Gauge, um 100 Mikroliter in C57 schwarze 6 Wildtyp-Mäusemitnahmen mit OT1 GFP- oder OT1-RFP-Zellen intravenös zu injizieren. Um die Zytokinsekretion 6 Stunden vor dem Opfer der Maus zu blockieren, injizieren Sie 250 Mikrogramm BFA und 200 Mikroliter PBS intraperitoneal mit der 29-Spur-Insulinspritze. Nach der Einschläferung von Mäusen mit Kohlendioxid und anschließender Zervixdislokation reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
Auf der linken Flanke der Maus, wo sich die Milz befindet, schneiden Sie mit einer Schere durch die Haut, um einen Schnitt von ein bis zwei Zentimetern zu machen. Dann, sorgfältig einen Schnitt in das Peritoneum machen, um die Milz zu entblößen und nehmen Sie es mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, es nicht mit Zangen zu drücken oder zu schneiden, um zu vermeiden, dass die Milzarchitektur gestört wird.
Bereiten Sie nun die fixative Lösung vor, indem Sie 3,75 Milliliter PBS und 3,75 Milliliter 0,2 Mol L-Lysin mischen. Fügen Sie 21 Milligramm Natrium m-Periodat hinzu und mischen Sie gut. Dann fügen Sie 2,5 Milliliter 4%PFA und 20 Mikroliter 12 normales Natriumhydroxid hinzu.
Die Milz in drei Teile schneiden. Die Milz in der Fixierung in eine Sechs-Well-Platte untertauchen und mindestens vier Stunden fixieren. Eine typische Fixierungszeit beträgt 16 bis 20 Stunden bei vier Grad Celsius unter sanfter Erregung.
Danach entsorgen Sie die fixative Lösung und fügen Sie fünf Milliliter PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Rührung hinzu. Dann ersetzen Sie die PBS durch fünf Milliliter 30%Saccharose und inkubieren für 12 bis 24 Stunden, um die Gewebemorphologie zu erhalten. Nun sinkt die Orgel am Boden der Platte.
Um die Probe einzufrieren, trockenes Eis in einen großen Behälter geben und einen kleineren Behälter darin platzieren, der etwa 50 Milliliter reines Methanol und ein paar Stück Trockeneis enthält. Die Milz vorsichtig auf einem fusselfreien Tuch trocknen. Tropfen Sie einen Tropfen OCT-Verbindung an der Unterseite der Basisform und legen Sie die Milz in die Form.
Achten Sie darauf, keine Blasen zu produzieren. Fügen Sie etwa einen Milliliter OCT über die Milz. Mit Zangen die Basisform auf der Oberfläche des Methanols im Trockeneisbad ablagern, um sicherzustellen, dass das Methanol das OCT nicht berührt.
Das ÜLG verdickt sich und wird weiß, wenn es gefroren wird. Denken Sie daran, das Gewebe so schnell wie möglich einzufrieren, um Artefakte zu minimieren. Auf einem Kryo-Mikrotome, auf die Temperatur von minus 20 Grad Celsius eingestellt.
Schneiden Sie das Gewebe auf die gewünschte Dicke, etwa 10 Mikrometer. Verwenden Sie eine Bürste, um Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias zu sammeln und visuell zu inspizieren. Lassen Sie die Abschnitte auf Raumtemperatur kommen.
Zeichnen Sie einen Kreis mit Flüssigkeitsblocker, z. B. einen PAP-Stift, um den Gewebeabschnitt außerhalb des OCT. Sobald das Gewebe getrocknet ist, rehydrieren Sie die Probe, indem Sie 100 Mikroliter PBS für fünf Minuten auf den Gewebeabschnitt tropfen. Entfernen Sie dann die PBS aus dem Abschnitt durch Aspiration und fügen Sie 100 Mikroliter Blockierlösung pro Probenabschnitt hinzu.
In kubisieren in einer überdachten Nasskammer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Um mit primären Antikörpern zu färben, ersetzen Sie die Blockierlösung durch den vorbereiteten primären Antikörpermix für jede Probe. Vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius in einer überdachten Nasskammer bebrüten, bevor sie nach dem Manuskript gewaschen werden.
Verdünnen Sie nun die sekundären Antikörper, die von Interesse sind, auf eine optimale Konzentration, in der Regel 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, in der Blockierlösung. Entfernen Sie die endige Waschlösung aus dem Abschnitt und fügen Sie die vorbereitete Sekundärantikörpermischung auf den Abschnitt und inkubieren Sie für ein bis vier Stunden bei Raumtemperatur in einer überdachten Nasskammer. Nach dem Waschen mit Waschpuffer nach dem Manuskript, entfernen Sie die Waschlösung und führen Sie eine endende Wäsche mit PBS.
Die phosphatgepufferte Saline ansaugen und das restliche PBS verdampfen lassen, ohne dass der Abschnitt vollständig austrocknet. Zeichnen Sie einen Kreis um den Abschnitt auf der Rückseite der Folie. Legen Sie dann einen Tropfen des Montagemediums auf die Probe, stellen Sie sicher, dass das Medium den gesamten Abschnitt bedeckt, und legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Oberseite.
Lassen Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Platzieren Sie das Dia am Morgen unter einem invertierten Spektrallaser-Scanning-Mikroskop. Passen Sie das Objektiv auf 10x NA 0.40 oder 60x NA 1.4 für die Analyse der subzellulären Lokalisation von Zytokin an.
In diesem Protokoll werden Zellen, die Interferon-Gamma erzeugen, visualisiert und lokalisiert. Der Marker F4/80 beschriftet alle Makrophagen und hebt das rote Fruchtfleisch hervor. Der Marker B220 beschriftet B-Zellen und hebt B-Zellfollikel hervor, die die T-Zell-Zone umgeben.
Der Marker CD169 kennzeichnet Marginalzonenmakrophagen, die den weißen Zellstoff umgeben. 24 Stunden nach der Infektion wird Interferon-Gamma von mehreren Zellen produziert, einschließlich aktivierter antigenspezifischer OT1 CD8-T-Zellen und NK-Zellen. Ohne die Verwendung von BFA zur Hemmung der Zytokinsekretion wurde der Nachweis von Interferon-Gamma durch NK-Zellen stark beeinträchtigt.
B-Zellen, Marginalzonen-Makrophagen und alle Makrophagen wurden gefärbt, um die Position von Interferon-Gamma produzierenden Zellen nach einer LM OVA-Infektion abzubilden. Interessanterweise wurden gebündelte Antigen-spezifische T-Zellen im weißen Zellstoff der Milz gefunden, aber sie produzieren Interferon-Gamma nur in Regionen, in denen NK-Zellen mit ihnen koexistierten. Es wurde eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation von Interferon-Gamma und NK im Vergleich zu CD8-positiven T-Zellen gezeigt.
Während die Interferon-Gamma-Lokalisierung in NK-Zellen im Zytosol diffundiert wurde, rekrutierten CD8-positive T-Zellen häufig Interferon-Gamma in Richtung einer anderen T-Zelle. Die Injektion von Brefeldin A ist entscheidend, um das Zytokin in situ zu erkennen. Zellen sezernieren und nehmen die Zytokine oft schnell auf, und wir müssen die Zytokinsekretion hemmen, damit sie sich in den Zellen ansammeln kann.
Diese Methode ist ein Erkennungstool, das die Zytokin produzierenden Zellen in ihrer nativen Umgebung zurücksetzt. Die Entschlüsselung der Zusammensetzung dieser Umgebung ermöglicht es uns, uns auf die richtigen Zellen oder Immunmediatoren zu konzentrieren, die an diesem Ort vorhanden sind und sich durch Interferon-Gamma auswirken oder beeinflusst werden können. Es gibt ein wachsendes Verständnis, dass die genaue Lokalisierung einer Zelle in einem Gewebe entscheidend für ihre Funktion ist.
Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Lokalisation der Zytokin produzierenden Zellen zu identifizieren und dadurch ihre Funktion weiter zu charakterisieren.
