Dieses Protokoll vermittelt praktisches Wissen, das für die Formulierung von nanoskaligen Partikeln, d. h. Nanoscheiben, nützlich ist, die eine breite Palette hydrophober bioaktiver Moleküle stabil enthalten. Diese Methode hat viele praktische Anwendungen.
Die Fähigkeit, ansonsten unlöslichen bioaktiven Verbindungen wässrige Löslichkeit zu verleihen, ermöglicht den Einsatz von Nanodisks in Anwendungen zur Verabreichung von Medikamenten. Die beschriebene Methode ist einfach. Es wird bevorzugt, Studien in der beschriebenen Größenordnung durchzuführen, fünf Milligramm Phospholipid, zwei Milligramm Gerüstprotein, so dass die Bildung von Nanoscheiben leicht durch visuelle Inspektion überwacht werden kann.
Michael Karo und Matthew Swackhammer, studentische Forscher im Ryan-Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Um ein Phospholipidaliquot herzustellen, wiegen Sie fünf Milligramm DMPC ab und geben Sie es in ein Reagenzglas aus Glas. Lösen Sie das Phospholipid auf, indem Sie 300 Mikroliter Chloroform und 100 Mikroliter Methanol im Verhältnis drei zu eins hinzufügen.
Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel, indem Sie das Glasreagenzglas 10 bis 15 Minuten lang unter einen sanften Strom von Stickstoffgas stellen, so dass sich ein dünner Film aus getrocknetem Phospholipid entlang der Wände des unteren Teils des Röhrchens bildet. Um Amphotericin B oder AmpB-Nanodisks zu formulieren, pipettieren Sie 450 Mikroliter PBS in das lyophilisierte Phospholipid-Aliquot und wirbeln Sie 30 Sekunden lang, um das Lipid zu dispergieren. Pipettieren Sie 50 Mikroliter mit 20 Milligramm pro Milliliter AmpB-Lösung in die dispergierte Phospholipidprobe und den Vortex.
Geben Sie 500 Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter ApoE4 NT-Gerüstprotein in das Glasreagenzglas, das das dispergierte Phospholipid und AmpB enthält. Beschallen Sie die Probe im Bad bei 24 Grad Celsius, bis sich die Lösung geklärt hat. Für die AmpB-Nanodisk-Dialyse bereiten Sie einen Abschnitt des Dialyseschlauchs vor, indem Sie ihn 10 Minuten lang gründlich in destilliertem Wasser einweichen.
Klemmen Sie mit einer Dialyseschlauchklemme ein Ende des getränkten Dialyseschlauchs ein, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit austreten kann. Führen Sie einen schmalen Trichter in das offene Ende des Dialyseschlauchs ein und übertragen Sie die AmpB-Nanodisk-Probe in den Dialyseschlauch. Entfernen Sie den Trichter und klemmen Sie das Ende des Dialyseschlauchs mit einer anderen Dialyseschlauchklemme ab.
Setzen Sie einen Schaumstoff-Dialyseschlauch auf eines der versiegelten Enden des Dialyseschlauchs und legen Sie den zusammengebauten Dialyseschlauch in das Becherglas mit frisch zubereitetem Ein-Liter-PBS-Puffer. Setzen Sie einen magnetischen Rührstab in den Boden des Becherglases ein und stellen Sie den Rührregler auf niedrig, um sicherzustellen, dass kein Wirbel entsteht. Lassen Sie die Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius weiterlaufen.
Schalten Sie das Spektralfotometer ein, indem Sie den Netzschalter umlegen, und stellen Sie eine Verbindung zu einem entsprechenden Support-Computer her, indem Sie die PC-Steuerung drücken. Öffnen Sie auf dem Support-Computer die Software mit der Bezeichnung UVProbe 2.61 und stellen Sie eine Verbindung zum Spektralphotometer her, indem Sie in der unteren linken Ecke auf "Verbinden" klicken. Klicken Sie auf das Spektrum und dann auf "Methode"in der oberen Symbolleiste.
Klicken Sie auf die Registerkarte "Messung" und geben Sie 500 in das Textfeld "Start" unter "Wellenlängenbereich" und 300 in das Textfeld "Ende" ein. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben der Registerkarte mit der Bezeichnung Scangeschwindigkeit"und stellen Sie es auf mittel ein. Bereiten Sie einen Probenrohling vor, indem Sie einen Milliliter DMSO in zwei Quarzküvetten umfüllen.
Legen Sie beide Küvetten in die entsprechenden Probenöffnungen des Spektralphotometers. Klicken Sie auf automatisch leer"und nehmen Sie ein Spektrum von 300 bis 500 Nanometern auf, indem Sie auf "Start"in der unteren linken Ecke. Entfernen Sie für die AmpB-Standardspektralanalyse die Küvette aus dem vorderen Probenanschluss und fügen Sie 20 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter AmpB-Stammlösung hinzu.
Legen Sie die Küvette wieder in die Probentafel ein und klicken Sie auf "Start", um die Probenabsorption aufzuzeichnen. Entfernen Sie nach der Aufzeichnung der Probenaufnahme die Küvette und füllen Sie den flüssigen Inhalt in einen Abfallbehälter um. Spülen Sie die Küvette gründlich mit drei Waschgängen deionisiertem Wasser aus, gefolgt von drei Waschgängen mit 70%igem Ethanol.
Für die Spektralanalyse von gestörter AmpB-Nanodisk wird die Probe vorbereitet, indem Sie 20 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter AmpB-Nanodisk-Stamm in einen Milliliter DMSO pipettieren und eine Minute lang inkubieren, bevor das Spektrum aufgezeichnet wird. Legen Sie die Küvette in den vorderen Probenanschluss ein und klicken Sie auf "Start", um die Probenabsorption aufzuzeichnen. Für die Spektralanalyse eines PBS-Pufferrohlings bereiten Sie einen Rohling vor, indem Sie einen Milliliter PBS in zwei Quarzküvetten überführen.
Legen Sie die Küvetten in den Probenanschluss. Klicken Sie auf "Auto Blank" und nehmen Sie das Spektrum von 300 bis 500 Nanometern auf. Für die Spektralanalyse einer ungestörten AmpB-Nanodisk-Probe entfernen Sie die Küvette aus dem vorderen Probenanschluss und geben 20 Mikroliter einer AmpB-Nanodisk-Probe von einem Milligramm pro Milliliter in den PBS-Puffer.
Legen Sie die Küvette wieder in die Probenplatine ein. Klicken Sie auf "Start" und nehmen Sie das Probenspektrum auf. Die AmpB-Nanodisk-Formulierungsreaktion gilt als abgeschlossen, wenn das Erscheinungsbild der Probe von trüb zu klar übergeht.
Gezeigt wird die UV-sichtbare Absorptionsspektroskopie von AmpB-Proben in DMSO und PBS. In DMSO wurden drei unterschiedliche Absorptionsmaxima bei 372, 392 und 415 Nanometern beobachtet, Peaks, die auf AmpB hindeuten. Die Absorptionsspektren von AmpB-Nanodisks in PBS zeigten einen einzigen großen Absorptionspeak bei kürzerer Wellenlänge.
Im Vergleich dazu erschienen die Absorptionsspektren von AmpB-Nanodisks in DMSO ähnlich wie die Spektren von Standard-AmpB. Die biologische Aktivität von AmpB-Nanodisks wurde durch die Bewertung von Hefewachstumshemmungsassays durchgeführt. Kontrollproben wie PBS, DMSO und rekonstituierte High-Density-Lipoproteine zeigten, dass andere Nanodisk-Komponenten als AmpB keinen erkennbaren Einfluss auf das Hefewachstum haben.
Die Positivkontrolle bestätigte, dass AmpB ein effizienter Inhibitor des Hefewachstums ist. Im Fall von AmpB-Nanodisks wurde eine konzentrationsabhängige Wachstumshemmungsaktivität beobachtet. Nanodisk-Präparate sind nicht gleich Nanodisk-Präparate.
Einige benötigen möglicherweise mehr Zeit, andere Lipide oder andere Gerüstproteine. Sie sind nur undeutlich}ist die Klärung der Nanodisk-Probe. Diese Technik hat zu neuartigen Nanopartikeln geführt, die zur Untersuchung von Doxorubicin-induzierter Kardiotoxizität, Apoptose und Ligandeninteraktionen verwendet werden, und lieferte zahlreiche wässrige unlösliche bioaktive Moleküle, darunter Lutein und Curcumin.
