Die mitochondriale Funktion ist entscheidend für die hämatopoetische Stammzell-Selbsterneuerung. Mitochondrienaktivität ist ein Reflektor des inneren mitochondrialen Membranpotentials, das mit TMRM, einem zellfluoreszierenden, zellpermeant kationischen Farbstoff, gemessen werden kann. Xenobiotische Efflux-Pumpen sind in HSC sehr aktiv und verursachen TMRM-Extrusion.
Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Korrektur dieses Effekts, wobei Verapamil, ein Inhibitor der Effluxpumpen, verwendet wird. Beginnen Sie mit der Isolierung des Knochenmarks von Denfemuren der Maus. Verwenden Sie ein Paar Zangen und scharfe Schere, um die beiden hinteren Pfoten zu schneiden.
Dann machen Sie einen kleinen Schnipsel in der ventralen Haut der Maus, und dehnen Sie es. Extrahieren Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia, wobei Sie darauf achten, die Köpfe des Oberschenkelknochens nicht zu lösen, und legen Sie die Knochen in eine Sechs-Brunnen-Platte, gefüllt mit 1,5 Milliliter Färbepuffer. Entfernen Sie die Muskeln aus den Knochen, und schneiden Sie die Enden der Knochen, so dass Knochenmark zu verlassen.
Legen Sie die gereinigten Knochen in neue Brunnen, mit 1,5 Milliliter Nstrich. Dann spülen Sie das Knochenmark mit einer Drei-Milliliter-Spritze und einer 25-Meter-Nadel aus, bis der Knochen weiß wird. Sammeln Sie alle Zellen in einem 1,5 Milliliter-Rohr, und zentrifugieren Sie sie für fünf Minuten bei 180 mal G, dann entsorgen Sie den Überstand.
Das Pellet vorsichtig in 300 Mikrolitere eiskaltem ACK-Lysing-Puffer aussetzen und die Zellen für eine Minute auf Eis legen. Deaktivieren Sie dann sofort die Lyse, indem Sie einen Milliliter Färbepuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 180-fachg. G.Resuspend das Zellpellet, das weiß erscheinen sollte, in einem Milliliter Färbepuffer.
Filtern Sie die Zellen mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um mononukleäre Zellen zu erhalten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Linie Cocktail, und Fluorophor konjugierte Antikörper, nach Manuskript Richtungen. Bewahren Sie die Antikörper auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht.
Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 180 mal G und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 400 Mikroliter des Lineage-Cocktails und vier Mikroliter CD135-Biotinyl-Antikörper in das Zellpellet und wirbeln Sie die Mischung aus. Dann inkubieren Sie es auf Eis für 30 Minuten.
Waschen Sie die Probe nach der Inkubation, indem Sie drei Milliliter Färbepuffer hinzufügen, sie fünf Minuten bei 180 mal G nach unten drehen und den Überstand entsorgen. Dann 400 Mikroliter Antikörperlösung hinzufügen und die Mischung wirbeln. Bebrüte es noch 30 Minuten auf Eis und die Wäsche mit dem Färbepuffer wiederholen.
Um die TMRM-Färbelösung vorzubereiten, fügen Sie 2,2 Mikroliter TMRM-Stammlösung und 1,1 Mikroliter Verapamil zu 1,1 Milliliter serumfreies hämatopoetisches Kulturmedium mit Thrombopoietin und Stammzellfaktor hinzu. Setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter der TMRM-Färbelösung wieder auf, wirbeln Sie schnell aus und brüten Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie die Probe mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden.
Fügen Sie dann einen Mikroliter DAPI hinzu und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort. Führen Sie die Knochenmarkprobe aus, und erfassen Sie mindestens eine Million Ereignisse. Zeigen Sie dann die lebenden Knochenmark-Mononuklezellen in einem Diagramm für pazifisches Blau an, um CD135 Lin-negative und Lin-positive Fraktionen zu identifizieren.
Plotten Sie die Lin-negative Fraktion für APC/Cy7 im Vergleich zu PE/Cy7, um den multipotenten Vorläufer oder mPP-Anteil zu identifizieren. Zeichnen Sie dann die MPP-Fraktion für APC versus PerCP/Cy5.5, um die hämatopoetische Stammzelle oder HSC-Fraktion zu identifizieren. Zeigen Sie den HSC-Anteil für FITC oder CD34 an, um ihn in CD34-negative HSC- und CD34-positive HSC-Fraktionen aufzuteilen.
Schließlich erwerben Sie die TMRM-Intensität in jeder Population. Um sicherzustellen, dass die TMRM-Färbung korrekt funktioniert, fügen Sie der Probe einen Mikroliter FCCP für eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dann erwerben Sie eine Million Ereignisse.
Nach der FCCP-Zugabe sollte die TMRM-Intensität drastisch erhöht werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um das mitochondriale Membranpotenzial in verschiedenen Zellpopulationen mit TMRM-Farbstoff zu quantifizieren. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von PBS und FBS im Kulturmedium die TMRM-Signalintensität beeinflusst.
Daher ist es wichtig, TMRM Färbung in serumfreien Expansionsmedium durchzuführen. Hämatopoetische Stammzellen drücken hohe Aktivitätsniveaus von xenobiotischen Effluxpumpen aus, die TMRM-Farbstoff extrudieren. So variieren TMRM Profile auch in Gegenwart von Verapamil oder Cyclosporin H, die die Pumpen blockieren.
Um die Genauigkeit der TMRM-Färbung zu überprüfen, kann FCCP die Mitochondrien depolarisieren und die TMRM-Intensität reduzieren. Dieses Protokoll kann leicht für das Studium von HSC mit einem anderen mitochondrialen Membranpotentialfarbstoff, einschließlich TMRE oder JC-1, angepasst werden. Ebenso wie andere mitochondriale Farbstoffe wie MitoTracker oder MitoSOX.
Die kritischen Probleme, die durch die unterschiedliche Aktivität von Efflux-Pumpen unter der Knochenmarkpopulation geerbt wurden, wurden erst vor kurzem aufgezeigt. Dieses Protokoll zielt daher darauf ab, die Diskrepanz zwischen früheren Erkenntnissen zu verringern.
