Das beschriebene Protokoll ermöglicht die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Knochenmarks sowie von Knochenmarkstromazellen. Es kann verwendet werden, um Störungen dieser Populationen in verschiedenen Umgebungen zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen bisher beschriebenen Methoden ermöglicht diese Technik die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen, insbesondere in den beiden funktionellen Markbereichen, endostealem und zentralem Knochenmark, sowie Knochenmarkstromazellen.
Legen Sie das eingeschläferte Tier zunächst mit dem Bauch nach oben auf eine Petrischale und besprühen Sie es mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Bauch und ziehen Sie die Haut bis zu den Knöcheln weg. Greifen Sie eines der Beine und schneiden Sie es unten ab, um es mit einer Schere vom Tier zu trennen.
Entfernen Sie dann den Fuß vom Bein, indem Sie am Knöchel schneiden, und legen Sie das Bein in eiskaltes PBS 2%FBS. Als nächstes greifst du den Hüftknochen mit einer Pinzette und schneidest ihn mit einer Schere dahinter, um ihn vom Tier zu trennen. Legen Sie den Hüftknochen in eiskaltes PBS 2%FBS.
Nachdem Sie das Bein und den Hüftknochen in eine Petrischale gelegt haben, reinigen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell. Trennen Sie dann Schien- und Oberschenkelknochen, indem Sie mit dem Skalpell am Knie schneiden und die sauberen Knochen in eiskaltes PBS 2%FBS legen. Legen Sie den Oberschenkelknochen oder das Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2%FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken.
Als nächstes pipettieren Sie die resultierende Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette auf und ab, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, das auf das Röhrchen gelegt wird, in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2%FBS ab und füllen Sie die Lösung in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen durch dasselbe 40-Mikrometer-Zellensieb. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer bei Raumtemperatur durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden 15 Milliliter PBS 2%FBS hinzugefügt und das 50-Milliliter-Röhrchen zentrifugiert. Wenn das Zellpellet nicht rötlich aussieht, entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS 2%FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.
Nachdem Sie den Knochen wie zuvor gezeigt zerkleinert haben, schneiden Sie die Spitze einer P1000-Pipette mit einer Schere ab und füllen Sie damit den gesamten Inhalt des Mörtels in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird das 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Kollagenase IV und dieser Dispase-II-Lösung.
Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten. Füllen Sie das Röhrchen auf 25 Milliliter mit PBS 2%FBS auf und wirbeln Sie es aus. Anschließend wird der Inhalt durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.
Geben Sie dann 15 Milliliter PBS 2%FBS in das alte 50-Milliliter-Röhrchen und überführen Sie die Lösung durch das 100-Mikrometer-Zellensieb in das neue 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert, indem man mit einer Pipette mehrmals auf und ab pipettiert. Nach der zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 15 Milliliter PBS 2%FBS zugeben.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut, und wenn das Zellpellet nach dem Verwerfen des Überstandes nicht rötlich aussieht, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS 2%FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Anschließend wird die Platte bei 500 G drei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Legen Sie den Oberschenkelknochen auf eine Petrischale und schneiden Sie die Knochenenden mit einem sterilen Skalpell ab.
Spülen Sie dann den zentralen Teil des Knochens, indem Sie 100 Mikroliter PBS 2%FBS einmal von jeder Seite mit einer 0,5-Milliliter-Insulinspritze ohne Totvolumen durch das Innere des Knochens führen und die Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter PBS 2%FBS auffangen. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das als gespültes Knochenmark bezeichnet wird und vier Milliliter PBS 2%FBS enthält. Zerstoßen Sie die Enden des Knochens in einem Mörser mit eiskaltem PBS 2%FBS, indem Sie sie mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken.
Sobald die Zellsuspension homogenisiert ist, wird sie durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das als zerkleinertes Knochenmark gekennzeichnet ist. Zum Schluss spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2%FBS aus und geben Sie die Lösung in dasselbe Röhrchen. Die Durchflusszytometrie von hämatopoetischen Stammzellen und multipotenten Vorläuferzellen wurde im gesamten Knochenmark einer gesunden jungen erwachsenen C57BL6J-Maus durchgeführt.
Bei der Analyse von Stromazellen, Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen im gesamten Knochenmark können mesenchymale Stammzellen anhand der Leptinrezeptorexpression und Endothelzellen anhand der Expression von CD31 und SCA-1 identifiziert werden. Durchflusszytometrische Analyse von Endothelzellen im Gesamtknochenmark zeigt die Unterscheidung zwischen arteriolären und sinusoidalen Endothelzellen auf der Grundlage von ICAM1. Die Quantifizierung von arteriellen und sinusoidalen Knochenmarkendothelzellen im zentralen und endostealen Knochenmarkgewebe zeigt, dass arterielle Knochenmarkendothelzellen häufiger in endostealen Regionen vorkommen, während Sinusoide häufiger in zentralen Knochenmarkbereichen vorkommen.
Bei der Entnahme von gespültem Knochenmark sollte das Volumen oder die Anzahl der Male, die für die Verabreichung von PBS 2%FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens angegeben sind, nicht überschritten werden. Die Kombination der beschriebenen Methode mit funktionellen Assays der phänotypisch analysierten Zellpopulationen würde weitere wertvolle Informationen über die möglichen Störungen dieser Populationen liefern, die unter den untersuchten Bedingungen auftreten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen im endostealen und zentralen Knochenmark, so dass die Forscher Störungen der Hämatopie untersuchen können, die möglicherweise spezifisch in diesen Knochenmarkslokalisationen auftreten.
