Während der Hämatopoese durchlaufen hämatopoetische Stammzellen einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um glykolytische und mitochondriale Funktionen von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Maus zu beurteilen. Mit dieser Methode kann die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit beurteilt werden.
Die 96-Well-Microplate-basierte Plattform bietet eine Quantifizierung mit hohem Durchsatz und hoher Empfindlichkeit, die die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben mit einer einzigen Platte ermöglicht. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Chemikalien oder genetischen Manipulationen auf den HSC-Stoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Es kann helfen, Stoffwechselwege aufzuklären, die die HSC-Pluripotenz aufrechterhalten.
Obwohl sich die aktuelle Studie hauptsächlich auf hämatopoetische Stämme und Vorläuferzellen der Maus konzentriert, könnten das Protokoll und dieser Ansatz leicht angepasst werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren. Öffnen Sie einen Tag vor dem Assay das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit, um die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe zu entfernen. Speichern Sie die Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.
Trennen Sie nun die Sensorkassette manuell von der Utility-Platte und legen Sie sie kopfüber neben die Utility-Platte. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung der Gebrauchsplatte mit 200 Mikrolitern Kalibrant, die im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten sind, und legen Sie dann die Sensorpatrone wieder auf die Utility-Platte, wobei Sie sicherstellen, dass die Sensoren vollständig in das Kaliber eingetaucht sind. Dann inkubieren Sie die Gebrauchsplatte mit Kalibrant und montierte Sensorkartusche in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht nach den im Manuskript genannten Befeuchtungsbedingungen.
Am Tag des Assays bereiten Sie 2,5 Milliliter der Zellklebelösung pro 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte, die im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten ist, und dosieren Sie 25 Mikroliter der vorbereiteten Zellklebelösung am Boden jeder Vertiefung. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Haube.
Entfernen und entsorgen Sie nach der Inkubation die überschüssige Zellklebelösung mit einer Mehrkanalpipette oder einem Aspirator und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern sterilem Reinstwasser. Trocknen Sie die Platte ohne Deckel in der Kapuze 30 bis 45 Minuten an der Luft. Zentrifugieren Sie die vorbereiteten negativen HSPCs der Mauslinie bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in das entsprechende Assay-Medium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal und suspendieren Sie die Zellen im entsprechenden erwärmten Assay-Medium auf die Konzentration von 250.000 Zellen pro 50 Mikroliter oder fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der Zellsuspension entlang der Seite jeder Vertiefung der mit Zellkleber beschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte hinzuzufügen, und fügen Sie dann 50 Mikroliter des Assay-Mediums in die Eck-Hintergrundmessquellen hinzu.
Erstellen Sie eine Zentrifugenwaagplatte, indem Sie 50 Mikroliter Wasser pro Bohrloch einer unbeschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Platte in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 25 bis 30 Minuten zur Zellbefestigung.
Nach 30 Minuten unter dem Mikroskop visuell bestätigen, dass die Zellen stabil an der Mikroplattenoberfläche haften. Beginnen Sie mit der Vorbereitung aller erforderlichen Lösungen im vorerwärmten Glykolyse-Stresstestmedium, wie im Textmanuskript erwähnt, und entfernen Sie die hydratisierte Sensorkartusche aus dem Inkubator. Heben Sie die Sensorpatrone aus dem Kalibrant heraus und ersetzen Sie sie auf derselben Gebrauchsplatte mit dem Kalibrant, um die Luftblasen zu entfernen.
Legen Sie die 80-Ladeführung flach auf die Oberseite der Sensorkassette und richten Sie sie so aus, dass sich der Buchstabe A in der oberen linken Ecke befindet. Dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter 100-Millimollar-Glucoselösung in Port A.Ersetzen Sie die 80-Ladeführung flach durch die BC-Ladeführung flach und richten Sie den Buchstaben B in der oberen linken Ecke aus. Geben Sie 22 Mikroliter 20 mikromolare Oligomycinlösung in Port B ab.Richten Sie die BC-Ladeführung flach aus, um den Buchstaben C in der oberen linken Ecke für das Laden von Port C zu finden, und geben Sie 25 Mikroliter 500 millimolare 2-Desoxy-d-Glucoselösung in Port C ab.Dann entfernen und entsorgen Sie die Ladeführung flach.
Erstellen oder laden Sie nun die Vorlage für den Glykolyse-Stresstest auf der Steuerung. Geben Sie die Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu.
Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden. Stellen Sie für die Basismessung und die Messungen nach jeder Injektion die Anzahl der Messzyklen auf drei ein und mischen, warten, messen Sie die Zeiten auf drei Minuten, null Minuten, drei Minuten. Klicken Sie in der Software auf Start Run.
Entfernen Sie den Deckel von der mit Verbindungen beladenen und hydratisierten Sensorpatrone und legen Sie ihn auf das Arbeitsfach des extrazellulären Flussmittelanalysators. Starten Sie den Kalibrierungslauf. Nehmen Sie die Mikrotiterplatte mit den ausgesäten Zellen aus dem Inkubator.
Ohne die Zellen zu stören, fügen Sie langsam 130 Mikroliter des vorgewärmten Glykolyse-Stresstestmediums pro Vertiefung hinzu, um das mittlere Volumen in jedem Vertiefungsraum auf 180 Mikroliter zu erhöhen, und bringen Sie die Platte für weitere 15 bis 20 Minuten in den Inkubator zurück. Klicken Sie in der Software auf Fach öffnen, um das Thermofach von Seahorse zu öffnen. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Gebrauchsplatte durch diese Assay-Mikroplatte, die die Zellen enthält, und drücken Sie die Wägezellenplatte, um die Messungen zu starten.
Entfernen Sie nach Abschluss der Messungen das Assay-Medium von der Platte, ohne die Zellen zu stören, und waschen Sie sie vorsichtig mit 250 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung, ohne die Zellen zu verdrängen. Geben Sie nun 10 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Lysepuffer, ergänzt mit 1X Protease-Inhibitor-Cocktail zu jeder Vertiefung und rühren Sie die Platte auf einem Shaker für 10 Minuten. Den ganzen Teller bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.
Tauen Sie die Platte auf und führen Sie einen Proteinmesstest zur Datennormalisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Rufen Sie die Daten ab und analysieren Sie sie, indem Sie die Datendatei mit der Wave-Desktop-Software öffnen. Klicken Sie auf Normalisieren, fügen Sie die Normalisierungswerte für jedes Bohrloch ein und klicken Sie dann auf Übernehmen, um die Daten zu normalisieren.
Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Glykolyse-Stresstest-Berichtsgenerator, um die analysierten Daten in einen Berichtsgenerator zu exportieren. Die nicht-glykolytische Ansäuerungsrate steigt mit zunehmender Zellzahl von 50.000 auf 250.000, steigt aber nur minimal zwischen 200.000 und 250.000. Die Injektion von 10 millimolarer Glukose stimuliert die Glykolyse bei allen Zellzahlen mit einem maximalen Anstieg der ECAR, der bei 250.000 Zellen pro Bohrung beobachtet wird.
Die Injektion von zwei Mikromolaren Oligomycin erhöht ECAR jedoch nicht weiter. Die OCR-Daten, die in den gleichen Glykolyse-Stresstests erhalten wurden, zeigen einen signifikanten Abfall nach der Oligomycin-Injektion aufgrund der Komplex-5-Hemmung. Glykolyse-Stresstestparameter wurden berechnet und 250.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Mikromolaren Oligomycin für weitere Studien ausgewählt.
Der mitochondriale Stresstest zeigte, dass zwei mikromolare Oligomycin-Injektionen eine signifikante Reduktion der OCR über die Hemmung von Komplex 5 verursachen. FCCP stimuliert OCR in HSPCs in einer dosisabhängigen Weise mit einem maximalen Anstieg an zwei Mikromolaren. Eine Mischung aus 0,5 Mikromolar Rotenon und 0,5 Mikromolar Antimycin A Injektion senkt OCR auf ihr minimales Niveau, das dem nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch entspricht.
Mitochondriale Stresstestparameter wurden berechnet und zwei Mikromolare FCCP wurden für weitere Studien ausgewählt. Angesichts des hohen Durchsatzcharakters dieser Technik könnte das hier beschriebene Protokoll leicht angepasst werden, um eine große Anzahl bioenergetischer Modulatoren in hämatopoetischen Stammzellen, hämatopoetischen Vorläuferzellen und bösartigen hämatopoetischen Zellen zu screenen. Die Seepferdchenanalyse wird in der Literatur häufig verwendet, um den Stoffwechsel in einer Vielzahl von Kontexten in Gegenwart verschiedener Substrate und Inhibitoren zu messen.
