In der klinischen Praxis ist es üblich anzunehmen, dass jede Eizelle, die einen polaren Körper zeigt, zur Befruchtung bereit ist. Die Lebensbildgebung der menschlichen Eizellreifung zeigt, dass ein polarer Körper sichtbar wird, lange bevor die bipolare Metaphase II Spindel zusammengesetzt wird, was das Risiko einer vorzeitigen Spermieninjektion verursacht. Polarisierte Lichtmikroskopie ermöglicht eine nicht-invasive Visualisierung der meiotischen Spindel in menschlichen Eizellen und kann in IFV sicher genutzt werden, um die Eireife vor der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion zu bewerten.
Die Optimierung des Timings des ICSI ist besonders wichtig bei schlechter Prognose von IVF-Zyklen, wobei eine geringe Anzahl von Eizellen für die Befruchtung zur Verfügung steht. Dieses klinische Verfahren ist eine Zusatztechnik zur Standard-IVF-Behandlung und sollte von erfahrenem Personal in Übereinstimmung mit guten Laborpraktiken vorgeformt werden. 35 bis 36 Stunden nach der humanen Choriongonadotropin-Injektion die entnommenen Cumulus-Oozyten-Komplexe in einem kohlendioxidunabhängigen Handhabungsmedium sammeln.
Die Eizellen 10 bis 15 Minuten in einem kohlendioxidunabhängigen Inkubator bei 37 Grad Celsius ausdemieren. Setzen Sie die Eizellen einer hohen Hyaluronidase-Lösung aus, die im Handhabungsmedium verdünnt wird. Verwenden Sie nach 30 Sekunden eine 200-Mikroliter-Pipette, um Cumulus-Corona-Zellen mechanisch zu entfernen.
Bewerten Sie die Anzahl und den Entwicklungsstatus der denuded Oozyten nach dem Vorhandensein oder Fehlen des Kerns und des ersten polaren Körpers. Das Keimbläschenstadium und die Metaphase I und die Metaphase II stufen Eizellen in einzelne Tröpfchen des kohlendioxidunabhängigen Kulturmediums, das mit Mineralöl bedeckt ist. Dann legen Sie die Eizellen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 6% Sauerstoff mit Feuchtigkeit für 3 bis 4 Stunden.
Um Kultivierungsplatten für die Embryokultur vorzubereiten, fügen Sie das entsprechende Volumen des vorädlibierten Kulturmediums zu einzelnen Brunnen einer entsprechend großen Kulturplatte hinzu. Bedecken Sie die Tröpfchen mit gleichgewichtiertem Mineralöl, beschriften Sie die Platte mit einer eindeutigen Kennung und legen Sie sie mindestens 20 Minuten in einen kohlendioxidabhängigen Dekubator. Um die ICSI-Schale vorzubereiten, fügen Sie 5 Mikroliter Tröpfchen vorgewärmtes Handhabungsmedium für jede polare Körper-Anzeige Oozyte, und ein zusätzliches Tröpfchen zum Nadelwaschen zu einer sauberen Kunststoffschale hinzu.
Fügen Sie ein zusätzliches Tröpfchen PVP-Lösung für die Immobilisierung der Spermien vor der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion hinzu und überlagern Sie die Tröpfchen mit vorgewärmten Mineralöl. Achten Sie darauf, das Gericht zu beschriften. Dann legen Sie die Spermieninjektionsschale mindestens 20 Minuten lang in einen kohlendioxidunabhängigen Inkubator.
Während die Platte ausgeglichen ist, fügen Sie 5 Mikroliter Tröpfchen vorgewärmtes Handhabungsmedium für jede polare Körper-Anzeige Oozyte zu einem Glasboden-Kulturgericht hinzu. Alle Tröpfchen mit vorgewärmten Mineralöl überlagern. Achten Sie darauf, das Gericht zu beschriften.
Legen Sie die Platte dann mindestens 20 Minuten in einen kohlendioxidunabhängigen Inkubator. Während die Platten ausgeglichen sind, schalten Sie die beheizte Bühne auf dem invertierten Mikroskop ein und passen Sie die sterile Halte- und Spermieninjektionsnadel in Mikroinjektionshalter ein. Bringen Sie die Nadeln in den Fokus, und wählen Sie das entsprechende Ziel aus, wobei Darauf zu achten ist, dass sich der Kondensator in der hellen Feldposition befindet.
Setzen Sie den grünen Interferenzfilter ein, und stellen Sie den Schieberegler für die Flüssigkristallanalyse auf die Arbeitsposition ein. Stellen Sie den Verschluss auf ca. 50 % ein und passen Sie den kreisförmigen Polarisator an, um Hintergrundgeräusche zu verringern. Um den Computer für die Untersuchung der polarisierten Lichtmikroskopie einzurichten, starten Sie die Bildgebungssoftware, und wählen Sie im Videomenü Video, Videoquelle und polarAIDE aus.
Wechseln Sie dann zu Live-Videos, indem Sie zur Videoseite gehen, und wählen Sie das Symbol aus, um die Spindel- und Zonaanalyse zu aktivieren. Um die Reife jeder Eizelle zu bestimmen, übertragen Sie alle Eizellen in einzelne Tröpfchen auf die vorbereitete Glasbodenschale und legen Sie die Schale unter das vorbereitete invertierte Mikroskop. Bringen Sie die erste Oozyte in den Fokus, und beobachten Sie das erkannte Eizellen-Birefabenzbild, da es computerverarbeitet und in Echtzeit auf dem Computerbildschirm angezeigt wird.
Verwenden Sie die Halte- und Spermien-Injektionsnadeln, um die Oozyte zu drehen, so dass sich der polare Körper in der 12-Uhr-Position befindet und sich auf den polaren Körper konzentriert. Wenn die Spindel-Birefreringen in der Nähe von PB auf den ersten Blick nicht deutlich sichtbar ist, berühren Sie leicht die Zona pellucida und drehen Sie vorsichtig die Eizelle um jede Achse, um die Ausrichtung des polarisierten Lichts mit den Arrayspindelfasern zu gewährleisten. Nachdem Alle Spindel-positiven Eizellen identifiziert wurden, übertragen Sie die Eizellen in einzelne Tröpfchen innerhalb der vorbereiteten ICSI-Schale und unterwerfen Sie die Eizellen einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion nach Standardprotokollen.
Wenn die Eizellen kein nachweisbares Metaphase-II-Spindelsignal aufweisen, legen Sie die polarisierte Lichtmikroskopschale 2 bis 3 Stunden in den kohlendioxidunabhängigen Inkubator. Bevor die polarisierte Lichtmikroskopie-Untersuchung, wie gezeigt, nach der Injektion neu vorformt, übertragen Sie die Eizellen auf die vorbereiteten Embryo-Kultivierungsplatten für ihre Kultur, bis das Blastozystenstadium erreicht ist. Achten Sie darauf, dass die gesamte Mikromanipulation der menschlichen Oozyte in einer Kontrollumgebung bei 37 Grad in einem optimalen Kulturmedium pH durchgeführt wird.
Die Spindelbildgebung ermöglicht die Diskriminierung vollreifer Eizellen, die in der Metaphase II verhaftet wurden, von denen, die sich einem wichtigen maturationalen Übergang unterzogen haben. In entwicklungsverzögerten Eizellen, die polare Körper in vitro extrudieren, kann das Fehlen des Metaphase-II-Spindelsignals nicht unbedingt eine zelluläre Störung widerspiegeln, sondern könnte das Fortschreiten der Eizelle von der Metaphase I zur Metaphase II anzeigen. Das Vorhandensein der meiotischen Spindel ist ein positiver Marker für die Entwicklungskompetenz von Eiern.
Das Aufschieben von ICSI bietet entwicklungsverzögerten Eizellen zusätzliche Zeit, um den Reifungsprozess abzuschließen und die Metaphase-II-Spindel vor ihrer Injektion zu montieren. Mit diesem Ansatz können selbst unreife Eizellen, die routinemäßig verworfen werden, klinisch genutzt werden und zu erfolgreichen Schwangerschaften führen.
